Génération de crête neurale du tronc à partir de cellules souches pluripotentes humaines

Rapports scientifiques volume 6, Numéro d'article : 19727 (2016) Citer cet article

7433 Accès

47 Citations

21 Altmétrique

Détails des métriques

Les cellules de crête neurale (NCC) sont des cellules souches qui génèrent différentes lignées, notamment neuroendocrines, mélanocytaires, cartilagineuses et osseuses. Le potentiel de différenciation de la NCC varie en fonction du niveau à partir duquel les cellules émergent le long du tube neural. Par exemple, seuls les NCC «crâniens» antérieurs forment l'os craniofacial, tandis que seuls les NCC «troncaux» postérieurs contribuent aux cellules sympathosurrénales. Il est important de noter que l'isolement du NCC fœtal humain comporte des défis éthiques et scientifiques, car l'induction du NCC se produit généralement avant que la grossesse ne soit détectable. Par conséquent, les connaissances actuelles sur la biologie de CNC proviennent principalement d'organismes non humains. Des différences importantes entre le NCC humain et non humain, telles que l'expression de HNK1 chez l'homme mais pas chez la souris, suggèrent la nécessité d'étudier directement le NCC humain. Ici, nous démontrons que les protocoles actuels pour différencier les cellules souches pluripotentes humaines (PSC) de NCC sont biaisés vers le NCC crânien. L'ajout d'acide rétinoïque a entraîné des marqueurs liés au tronc et des gènes HOX caractéristiques d'une identité postérieure. Un traitement ultérieur avec des protéines morphogénétiques osseuses (BMP) a amélioré la différenciation en cellules sympathosurrénales. Notre approche fournit une méthodologie pour des études détaillées de la NCC humaine et clarifie les rôles des rétinoïdes et des BMP dans la différenciation de la PSC humaine à la NCC du tronc et aux lignées sympathosurrénales.

Les cellules souches embryonnaires (CSE) de l'épiblaste se précisent progressivement au cours du développement, d'abord en couches germinales qui sont ensuite subdivisées. La couche ectodermique la plus externe contient des précurseurs de l'ectoderme neuronal et non neuronal1. Au cours de la neurulation, l'ectoderme neural devient un neuroépithélium qui formera le système nerveux central (SNC). Les précurseurs de la crête neurale sont initialement contenus dans ce neuroépithélium, mais subissent ensuite une transition épithéliale-mésenchymateuse, générant des cellules de la crête neurale (NCC) qui se délaminent du tube neural et migrent vers des endroits éloignés dans tout le corps. Les NCC sont multipotentes et contribuent à un large éventail de lignées distinctes, notamment les chondrocytes, les ostéocytes, les mélanocytes, les neurones sensoriels, les cellules musculaires lisses, les cellules de Schwann, les cellules chromaffines et les neurones sympathiques1,2. Tous les NCC ne se ressemblent pas, avec des populations distinctes existant le long de l'axe neuronal. Par exemple, la NCC provenant des niveaux crânien et du tronc peut se différencier en neurones, cellules gliales et cellules pigmentaires. Seules les cellules du niveau axial crânien contribuent à l'os et au cartilage du visage, alors que le tronc NCC n'a pas la capacité de le faire, même lorsqu'il est greffé à la tête. Inversement, les cellules sympatho-surrénales (SA) ne proviennent normalement que du tronc NCC.

Les connaissances actuelles sur le développement et la biologie de la NCC proviennent principalement d'études sur le poussin, le poisson zèbre et la souris1,2,3. Ces travaux ont permis de découvrir des marqueurs exprimés par NCC, notamment TFAP2A, FOXD3, B3GAT1 (HNK1), NGFR (p75), SOX9 et SOX104,5,6,7,8,9,10 et ont ensuite été validés chez l'homme11,12. Alors que ces gènes sont généralement exprimés dans la NCC à tous les niveaux axiaux, des activateurs distincts spécifiques au niveau axial conduisent l'expression de certains marqueurs. Par exemple, SOX10 est piloté par l'enhancer SOX10E2 dans le NCC crânien mais par SOX10E1 dans le tronc NCC13. De même, un amplificateur NC1 spécifique au crâne entraîne l'expression de FOXD3 dans la crête neurale crânienne, mais pas dans le tronc NCC14. Il existe également des facteurs de transcription sélectifs de la crête neurale au niveau axial. Par exemple, ETS1 est un facteur de transcription spécifique du NCC crânien15,16 et une entrée directe dans les activateurs crâniens du NCC Sox10E2 et NC1 pour FOXD3. Alors que de nombreux marqueurs de NCC crâniens sont connus17, les marqueurs spécifiques de NCC du tronc restent mal caractérisés.

La lignée SA est uniquement dérivée du tronc NCC. La différenciation du tronc NCC en cellules SA se produit lorsque le tronc NCC migre ventralement adjacent à l'aorte dorsale, qui sécrète des protéines morphogéniques osseuses (BMP) pour déclencher une régulation positive des marqueurs SA précoces tels que PHOX2B18,19,20. Les cellules SA sont des cellules progénitrices multipotentes qui donnent naissance à la fois à des neurones sympathiques et à des cellules neuroendocrines telles que les cellules chromaffines de la médullosurrénale. Ces cellules expriment des enzymes synthétiques catécholaminergiques, notamment la tyrosine hydroxylase (TH) et la dopamine bêta hydroxylase (DBH). Des défauts de la fonction de la médullosurrénale peuvent favoriser l'hypotension, tandis que la transformation de la médullosurrénale peut entraîner un phéochromocytome ou un neuroblastome21,22. Bien que des cellules SA non humaines aient été utilisées pour modéliser et étudier ces maladies22,23, des différences existent entre les systèmes cellulaires humains et non humains24,25. De même, des écarts de développement entre les NCC humains et non humains et entre les différentes espèces de NCC non humains ont également été identifiés5,11,12. Par conséquent, la génération d'une source renouvelable de tronc cellulaire humain NCC fournit un système fiable et représentatif pour étudier le développement humain et la maladie. Cependant, en plus des questions éthiques entourant l'isolement du tissu fœtal humain, l'obtention de NCC fœtal humain est particulièrement difficile car l'induction et la migration de NCC se produisent généralement avant que la grossesse ne soit détectée26. Ainsi, la différenciation des cellules souches pluripotentes humaines (PSC) en tronc NCC représente la méthode la plus réalisable pour obtenir le tronc humain NCC.

Les premiers protocoles pour convertir la PSC humaine en NCC utilisaient une double stratégie d'inhibition SMAD 27,28 bloquant la signalisation TGF-β et BMP. Un autre protocole de différenciation NCC a combiné l'inhibition de GSK3β (activation de la voie WNT) avec le blocage du TGF-β, mais n'a pas trouvé d'efficacité accrue avec l'inhibition de BMP29. En revanche, un protocole de différenciation NCC plus récent incluait également l'activation de WNT et nécessitait une inhibition transitoire de BMP pour induire une expression optimale du marqueur NCC SOX1030. Ainsi, le rôle de la signalisation BMP dans la différenciation de la PSC humaine à la NCC n'est toujours pas résolu et le sous-type de NCC produit par ces méthodes n'est pas clair.

Ici, nous avons évalué l'effet de l'inhibition du BMP sur la capacité à différencier le PSC humain du NCC et étudié le sous-type de NCC produit. Entre nos mains, le NCC dérivé d'un protocole qui ne manipulait pas la signalisation BMP supprimait les marqueurs du SNC dans une plus grande mesure qu'un protocole qui comportait une inhibition transitoire du BMP. Les NCC produits étaient de caractère crânien, exprimant des niveaux élevés du marqueur crânien NCC ETS1 et de faibles niveaux du marqueur progéniteur NCC du tronc, PHOX2B. En traitant les cellules avec de l'acide rétinoïque (RA) dans une fenêtre étroite de 2 à 3 jours, nous avons conduit la spécification plus en arrière vers le tronc NCC, identifiant plusieurs gènes HOX qui étaient régulés positivement dans le tronc mais pas le NCC crânien. Ces troncs NCC pouvaient se différencier spontanément et exprimer des marqueurs de mélanoblastes et de cellules SA. L'addition de BMP a encore stimulé l'expression des marqueurs SA, y compris l'enzyme de synthèse des catécholamines TH. Nos résultats clarifient le rôle de la signalisation BMP dans la différenciation NCC et SA tout en fournissant une méthodologie robuste pour générer une source renouvelable de cellules progénitrices du tronc humain NCC et SA.

Pour identifier un protocole de différenciation pour le tronc NCC, nous avons d'abord comparé les protocoles publiés par les laboratoires Dalton et Studer, qui différaient respectivement par l'absence ou la présence d'inhibition de BMP (LDN193189). Nous avons différencié une ligne ESC (H1) et iPSC (WTC) vers NCC en utilisant les deux protocoles. Pour maintenir la cohérence, nous avons utilisé le même inhibiteur de GSK3β et la même dose (CHIR99021, 3 uM) et utilisé l'inhibiteur de TGF-β, SB431542 à 10 uM, car nous avons vu une expression comparable des marqueurs NCC en utilisant 10 uM contre 20 uM de SB431542 (non montré ), la concentration originale utilisée dans le protocole de Dalton31. Enfin, nous avons arrêté les deux protocoles au jour 11 pour correspondre à la durée pendant laquelle les cellules ont été traitées avec le(s) inhibiteur(s) SMAD et GSK3β. Les marqueurs NCC TFAP2A, FOXD3, B3GAT1 (HNK1), NGFR (p75), SOX9 et SOX10 ont montré une régulation à la hausse en utilisant les deux protocoles, bien que le protocole sans inhibition de BMP ait montré une expression plus élevée pour la plupart des marqueurs (Fig. 1A, Figure supplémentaire S1). Des fibroblastes dermiques humains (HDF) ont été utilisés comme contrôle négatif pour les marqueurs NCC car l'expression de tous les marqueurs NCC était plus faible dans les HDF que dans les PSC (données non présentées). Pour confirmer que ces protocoles ont conduit spécifiquement à NCC, nous avons ensuite évalué l'expression de marqueurs liés au SNC qui sont généralement régulés à la baisse dans NCC (HES5, PAX6, DACH1, SOX1). L'inhibition de la BMP était associée à une expression accrue de ces marqueurs du SNC (Fig. 1B, Figure supplémentaire S1). L'analyse par immunofluorescence a confirmé que les NCC produits sans inhibition de la BMP étaient positifs pour les marqueurs NCC (par exemple HNK1, p75, SOX10, FOXD3) (Fig. 1C).

Le blocage de la signalisation BMP n'est pas nécessaire pour la différenciation NCC et favorise la régulation positive des marqueurs liés au SNC.

(A, B) H1 ESC ont été différenciés vers NCC via des protocoles publiés par le laboratoire Dalton ou Studer. À la fin de chaque protocole, l'expression des marqueurs NCC (A) ou des marqueurs liés au SNC (B) a été analysée par RT-qPCR et comparée à l'expression de ces marqueurs dans les fibroblastes dermiques humains (HDF). Le protocole Dalton a montré des niveaux plus élevés de marqueurs NCC, tout en supprimant les marqueurs liés au SNC par rapport au protocole Studer. (C) Analyse par immunofluorescence de la NCC dérivée du protocole Dalton pour les marqueurs NCC HNK1/p75 (en haut) et FOXD3/SOX10 (en bas). *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Les barres d'échelle représentent 50 μm.

Pour évaluer directement le rôle de la signalisation BMP dans l'expression des marqueurs NCC et CNS, nous avons comparé le protocole original de Dalton (SB431542 + CHIR99021 = "Protocol #1") avec un protocole modifié par l'ajout de l'inhibiteur BMP tout au long (SB431542 + CHIR99021 + LDN193189 = "Protocole #2") ou modifié à l'aide d'un calendrier d'ajout/retrait d'inhibiteur similaire au protocole Studer ("Protocole #3") (Figure supplémentaire S2). Les cellules H1 et WTC présentaient l'expression la plus élevée de la plupart des marqueurs NCC selon le protocole n ° 1 (Figure supplémentaire S2). L'ajout de l'inhibiteur de BMP LDN193189 (protocoles n ° 2 et n ° 3) a de nouveau augmenté l'expression des marqueurs du SNC qui devraient être négatifs dans le NCC, suggérant à la fois que l'inhibition du BMP favorisait réellement l'expression des marqueurs liés au SNC et que la différenciation du NCC ne nécessitait pas Inhibition du BMP (Figure supplémentaire S2).

Pour clarifier les sous-types de NCC produits, nous avons analysé ETS1, un marqueur pour le NCC crânien et PHOX2B, un marqueur pour les cellules progénitrices SA du tronc NCC. NCC dérivé du protocole n ° 1 a démontré une expression robuste de ETS1 (cranial NCC), sans changement dans l'expression de PHOX2B (tronc NCC) sur PSC (Fig. 2A). Ainsi, le protocole n ° 1 a conduit à la formation du sous-type crânien de NCC.

L'acide rétinoïque favorise la spécification des NCC du tronc.

(A) Analyse RT-qPCR des marqueurs NCC crâniens (ETS1) et du tronc (PHOX2B) de H1 et WTC différenciés via le protocole Dalton. (B) Schéma détaillant le moment du traitement à l'acide rétinoïque (RA) pendant la différenciation NCC. (C) Analyse RT-qPCR pour les marqueurs crâniens (ETS1) et du tronc (PHOX2B) des cellules H1 différenciées avec RA ajouté à partir de chaque jour indiqué, démontrant que l'ajout de RA au jour 3 ou 4 a entraîné une régulation positive maximale du tronc (PHOX2B) et suppression des marqueurs crâniens (ETS1). (D) Les NCC traités avec ou sans RA ont été colorés pour PHOX2B et DAPI. (E) Le pourcentage de cellules PHOX2B+ (PHOX2B+/DAPI) a été quantifié à l'aide d'ImageJ. (F, G) NCC différenciés sans ou avec RA (@ jour 3) ont été électroporés avec un plasmide mCherry exprimant constitutif et un rapporteur SOX10 E1-GFP activé spécifiquement dans le tronc NCC. Après 72 heures, les cellules ont été analysées pour l'expression de la GFP par immunofluorescence (F) et quantifiées à l'aide d'ImageJ (GFP + / mCherry +) (G) *p < 0,05, **p < 0,01. Les barres d'échelle représentent 50 μm.

Pour piloter le caractère NCC du tronc postérieur, nous avons évalué l'acide rétinoïque (RA), qui peut pousser les cellules vers un destin postérieur associé à une régulation à la hausse des gènes HOX à structuration postérieure32,33. Nous avons ajouté RA à différents moments et analysé l'expression de ETS1 (crânien) et PHOX2B (tronc) (Fig. 2B). L'ajout de RA entre les jours 3 et 4 régularise au maximum l'expression de PHOX2B et supprima simultanément l'expression de l'ARNm d'ETS1 (Fig. 2C, Figure supplémentaire S3). Pour évaluer les différences de cellule à cellule dans l'expression des gènes, nous avons effectué une analyse par immunofluorescence. La NCC traitée par la PR a augmenté les niveaux de protéine PHOX2B dans environ 25 % de la population cellulaire par rapport à la NCC non traitée par la PR (Fig. 2D, E), ce qui indique que le traitement par la PR entraîne une population hétérogène de NCC du tronc.

En plus de l'expression différentielle d'ETS1 et de PHOX2B, les NCC crâniens et du tronc diffèrent également par les éléments amplificateurs utilisés pour transcrire SOX1013. Pour évaluer comment RA influence l'utilisation de l'amplificateur NCC du tronc, nous avons co-électroporé un plasmide mCherry (contrôle) et un plasmide SOX10E1-GFP (marqueur du tronc NCC) dans NCC différencié sans ou avec ajout de RA au jour 3. Alors que mCherry était visible dans les deux types de cellules, la GFP était plus importante dans les cellules traitées par RA (p <0, 05) (Fig. 2F, G). Ainsi, RA favorise la spécification du tronc NCC.

De nombreux marqueurs NCC ne sont spécifiques ni au crâne ni au tronc NCC11. Cependant, étant donné que les NCC du tronc sont plus postérieurs que les NCC crâniens, les NCC du tronc expriment des gènes HOX alors que les NCC mésencéphaliques ne le font pas34,35. En fait, seuls les NCC du cerveau postérieur émergent du rhombomère 4 et expriment en outre des gènes HOX antérieurs de manière caudale. Les gènes HOX précédemment détectés dans le tronc NCC comprennent HOXA2, HOXA4, HOXA5, HOXB4-9, HOXC4, HOXC5, HOXC8, HOXD4 et HOXD936,37,38,39,40. L'analyse RT-qPCR de chacun de ces gènes HOX a révélé une régulation positive en réponse au traitement de la PR (tous à des niveaux statistiquement significatifs (p <0, 05), à l'exception de HOXB7) (Fig. 3A, B).

Le traitement de la PR régule à la hausse plusieurs gènes HOX et modifie le potentiel de différenciation de NCC.

(A, B) Trunk NCC ont été analysés via RT-qPCR pour (A) HOXA, HOXB, (B) HOXC et HOXD gènes précédemment décrits pour être détectés dans le tronc NCC et se sont avérés régulés positivement par rapport au NCC crânien (non traité avec RA). Tous les gènes sont exprimés à des niveaux statistiquement significatifs (p < 0,05) dans le NCC du tronc par rapport au NCC crânien, à l'exception de HOXB7 (ns = non significatif) (C) Le NCC du tronc a été comparé au NCC crânien pour les marqueurs progéniteurs NCC PHOX2B (sympathosurrénal), MITF mélanoblastes), S100β (cellules de Schwann) et TUBB3 (neurones). ***p < 0,001.

Pour déterminer si le traitement RA modifie le potentiel de différenciation du NCC résultant, nous avons analysé le NCC dérivé avec ou sans traitement RA pour l'expression de gènes de différents sous-types de progéniteurs NCC : PHOX2B pour les cellules SA, MITF pour les mélanoblastes, S100β pour les cellules de Schwann et TUBB3 pour les neurones. L'ajout de RA a augmenté les niveaux d'expression de PHOX2B et de MITF, a diminué S100β et n'a pas eu d'effet sur TUBB3 par rapport aux cellules non traitées avec RA (Fig. 3C). Ainsi, le traitement de la PR modifie le profil d'expression génique et le potentiel de différenciation de NCC.

Au cours du développement, les NCC du tronc migrent vers l'aorte dorsale et sont exposés aux BMP qui stimulent la différenciation vers les cellules SA41. ASCL1 et PHOX2B sont exprimés initialement et régulent ensuite à la hausse l'expression de PHOX2A et HAND2, qui à leur tour entraînent la transcription des enzymes synthétiques catécholamines TH et DBH19,42. Pour confirmer le potentiel de différenciation du tronc NCC dérivé de PSC le long de la lignée SA, nous avons donc différencié le tronc NCC dérivé de RA vers les cellules SA de stade avancé. Après avoir différencié la CSP humaine du tronc NCC, nous avons traité le tronc NCC avec BMP-2, BMP-4 ou BMP-7 pendant 2 semaines. Différents ligands BMP ont élevé les marqueurs SA à des degrés divers (par exemple, BMP-7 a stimulé l'expression la plus élevée de HAND2 tandis que BMP-2 a le plus augmenté les niveaux de PHOX2B) (Fig. 4A). Bien que la TH ait été le seul marqueur SA de stade tardif régulé positivement en réponse au traitement par BMP, la TH et la DBH ont augmenté spontanément dans le NCC traité par la PR au cours des 2 semaines par rapport au NCC non traité par la PR, comme observé par immunofluorescence (Fig. 4B). Ces données confirment que notre tronc NCC dérivé de PSC peut produire la lignée SA progénitrice du tronc NCC et répond au traitement BMP.

La signalisation BMP stimule l'expression des fabricants de SA.

(A) Trunk NCC ont été traités sans ou avec BMP-2, -4 ou -7 pendant 2 semaines et analysés via RT-qPCR pour les marqueurs SA (ASCL1, PHOX2B, HAND2, PHOX2A, TH, DBH), qui ont montré une régulation positive par rapport à CCN crânien. (B) L'expression des marqueurs SA tardifs TH et DBH a été confirmée par immunofluorescence. *p < 0,05. Les barres d'échelle représentent 50 μm.

Les protocoles initiaux pour différencier la CSP humaine de la neuroépithéliale et de la NCC utilisaient la double inhibition du SMAD en bloquant le TGF-β (via SB431542) et la signalisation BMP (via Noggin ou LDN-193189)27,28,43,44. Deux protocoles de différenciation NCC récemment décrits comprenaient l'activation de la signalisation WNT, ce qui a conduit à une génération plus efficace de NCC29,30. Une différence clé entre ces protocoles était l'utilisation de l'inhibition de la BMP pour induire la NCC. Alors que l'activation de la signalisation BMP peut supprimer la différenciation en NCC29,45, des études de développement chez les grenouilles, les oiseaux et les souris ont suggéré que l'inhibition de la signalisation BMP n'était pas nécessaire pour l'induction de la NCC46,47,48. Dans nos expériences, l'inhibition constante ou transitoire de la signalisation BMP n'a pas entraîné l'expression des marqueurs NCC, mais a augmenté l'expression des marqueurs liés au SNC (Fig. 1, Figure supplémentaire S1). Ainsi, l'inhibition du TGF-β et l'activation de la signalisation WNT étaient suffisantes pour induire l'expression de NCC mais pas des marqueurs neuroépithéliaux, tandis que le blocage de la signalisation BMP favorisait l'expression des marqueurs liés au SNC.

L'utilité des PSC humains dépend des protocoles pour différencier les PSC vers les types de cellules souhaités. Les protocoles actuels pour différencier les CSP humaines des NCC peuvent générer des neurones périphériques, des chondrocytes, des ostéocytes, des muscles lisses, des cellules de Schwann et des mélanocytes, mais n'ont pas produit de cellules SA dérivées du tronc NCC27,30,31,49. Ces protocoles pourraient-ils favoriser la NCC crânienne ? En effet, nous avons constaté qu'en l'absence de facteurs de caudalisation tels que la PR, les protocoles actuels biaisent en faveur de la NCC crânienne sur la base de la régulation à la hausse du marqueur ETS1 spécifique de la NCC crânienne (Fig. 2A). Nous démontrons que le traitement par PR pendant la différenciation NCC a favorisé un sous-type NCC du tronc plus caudal sur la base de plusieurs critères : [1] Régulation à la hausse du marqueur progéniteur NCC du tronc, PHOX2B et régulation à la baisse du marqueur crânien ETS1 (Fig. 2C), [2] Augmentation niveaux d'activité de l'enhancer E1 sur SOX10, qui est spécifique pour le tronc NCC (Fig. 2F, 2G), [3] Expression des gènes HOX postérieurs (Fig. 3A, B) et [4] Capacité à différencier et à exprimer SA au stade tardif marqueurs TH et DBH, qui sont uniques au tronc NCC (Fig. 4B). Ainsi, nos données démontrent pour la première fois, à notre connaissance, la capacité de générer du tronc humain NCC à partir de PSC humain.

En plus de générer une NCC de type tronc, le traitement de la PR modifie également l'expression génique de différents marqueurs progéniteurs de la NCC, suggérant un changement de biais vers la différenciation en lignées cellulaires particulières. Notre NCC traité par RA démontre une plus grande capacité à se différencier non seulement vers les cellules SA spécifiques du tronc, mais aussi vers les mélanoblastes (Fig. 3C). Ces NCC du tronc ont également démontré une diminution de l'expression du marqueur cellulaire de Schwann, S100β, une observation cohérente avec un rapport précédent selon lequel les cellules de Schwann dérivées de NCC peuvent ensuite se différencier en mélanoblastes50. Les différences apparentes de potentiel de différenciation entre les NCC non traités et traités avec la PR pourraient être le résultat de profils d'expression différentiels des gènes HOX, car les gènes HOX servent non seulement d'indicateurs de l'endroit où NCC apparaît le long du neuraxis, mais ont également des rôles fonctionnels dans la différenciation. Par exemple, l'expression de HOXA2 a été liée au blocage de la chondrogenèse dans le NCC crânien38,51, tandis que la surexpression de HOXB8 peut stimuler l'expression des marqueurs SA TH et DBH dans le NCC36 aviaire. Par conséquent, les gènes HOX jouent un rôle important dans la détermination de la capacité de différenciation de NCC. Notre tronc NCC dérivé de PSC humain exprimait des gènes HOX précédemment détectés dans le tronc NCC d'autres espèces (Fig. 3A, B).

L'induction par la PR de gènes HOX distincts suggère que cette approche peut être adaptée pour produire d'autres sous-types de NCC tels que les NCC vagaux et sacrés, en ajustant la concentration de RA et/ou en modifiant/ajoutant la concentration de CHIR99021, du facteur de croissance des fibroblastes (FGF) ou Growth Differentiation Factor (GDF), qui modifient le profil d'expression du gène HOX33. L'ajout de ces autres facteurs pourrait également améliorer l'efficacité de la génération du tronc NCC, car le traitement par PR a entraîné une population hétérogène, avec environ 25 % des cellules développant des caractéristiques de type tronc (Fig. 2D, E). Ces modèles humains basés sur la PSC de différents sous-types de NCC représentent des outils pour distinguer les sous-types de NCC et fournissent un modèle pertinent pour l'homme pour étudier la biologie de la NCC et comparer avec les résultats d'autres organismes. Une différence notable entre le NCC humain et le NCC de souris est l'expression de HNK1 spécifiquement chez l'homme, mais pas chez la souris NCC5. Ainsi, alors que les organismes modèles non humains ont largement informé la biologie de la NCC, la NCC dans les organismes modèles peut différer de la NCC humaine.

Bien qu'il ait été démontré que la stimulation BMP bloque la différenciation des PSC humains en NCC, le traitement BMP a également été impliqué dans la différenciation des cellules NCC du tronc en cellules SA, car les ARNm BMP-2/4/7 sont exprimés dans la paroi de l'aorte dorsale, un emplacement vers lequel le tronc NCC migre pour éventuellement se différencier vers les cellules SA52,53,54. Soutenant l'importance de la signalisation BMP dans la différenciation SA, le traitement de souris et aviaires NCC avec BMP-2, -4 ou -7 in vitro a conduit à une augmentation des niveaux de marqueurs SA précoces MASH1 (ASCL1) et PHOX2B42,52,53,55. Dans notre tronc NCC humain dérivé de la CSP, le traitement avec BMP-2, -4 ou -7 a stimulé l'expression des marqueurs SA précoces et tardifs (Fig. 4A, B). Le traitement avec des BMP n'a pas augmenté l'expression de l'ARNm de DBH dans nos études, peut-être en raison du temps limité pendant lequel ces cellules ont été cultivées avant le traitement par BMP. Les cellules peuvent être plus sensibles au BMP à des moments plus longs, car le DBH est l'un des derniers marqueurs SA.

Nos résultats sont les premiers, à notre connaissance, qui démontrent la différenciation de la CSP humaine en sous-type spécifique de NCC, à savoir le tronc NCC (en présence de PR) ou le NCC crânien (en l'absence de PR). Nous clarifions également que le blocage des BMP n'est pas nécessaire pour la différenciation des PSC humains en NCC, tandis que la stimulation des BMP du tronc NCC a amélioré l'expression de certains marqueurs SA. Ces NCC du tronc et crâniens dérivés de la PSC humaine peuvent être analysés plus en détail pour mieux comprendre la biologie de la NCC humaine et pour identifier les caractéristiques distinctives de chaque sous-type, ainsi que les différences spécifiques à l'espèce dans les sous-types de NCC distincts. Notre tronc NCC humain dérivé de PSC peut être davantage différencié en cellules SA, offrant un modèle cellulaire humain renouvelable pour étudier la biologie des cellules SA et pour les maladies dérivées des cellules SA.

WTC iPSC ont été obtenus à partir d'un adulte en bonne santé comme décrit précédemment49. Le consentement éclairé a été obtenu de tous les sujets. Tous les protocoles utilisés dans cette étude ont été approuvés par le comité de recherche sur les gamètes humains, les embryons et les cellules souches de l'Université de Californie, comité de surveillance de la recherche sur les cellules souches de San Francisco et les méthodes ont été appliquées conformément aux directives approuvées.

H1 ESC et WTC iPSC ont été maintenus sur des plaques à 6 puits revêtues de GelTrex (Life Technologies) dans un milieu mTeSR1 (Stemcell Technologies). Les cellules ont été passées à l'aide d'Accutase et étalées dans mTeSR1 avec 2 uM de Thiazoviven (Stemcell Technologies).

Le protocole de différenciation Studer NCC a été réalisé comme décrit précédemment30. Le protocole de différenciation Dalton NCC a été réalisé comme décrit précédemment31 avec des modifications. En bref, SB431542 (Tocris) a été utilisé à 10 uM au lieu de 20 uM et l'inhibiteur de GSK3β CHIR99021 (Tocris) a été utilisé à 3 uM au lieu de BIO. Pour les protocoles #2 et #3, LDN-193189 (Tocris) a été utilisé à 500 nM.

La différenciation de la PSC humaine en tronc NCC a été réalisée en utilisant le protocole Dalton modifié avec de l'acide rétinoïque (1 uM, Sigma Aldrich) ajouté à partir du jour 3 et maintenu pendant toute la durée du protocole (jour 11).

La différenciation du tronc NCC en cellules sympathosurrénales a utilisé le milieu modifié du protocole de Dalton avec différents BMP (tous de Peprotech), y compris BMP-2 (50 ng/mL), BMP-4 (50 ng/mL) ou BMP-7 (100 ng/mL) pendant 2 semaines.

L'ARN a été extrait à l'aide d'un kit d'extraction d'ARN (Zymo Research) et la synthèse d'ADNc a été réalisée avec vilo (Life Technologies). La qPCR a été réalisée à l'aide de SYBR green (KAPA Biosystems) sur un AB7900HT. L'expression génique a été normalisée à GAPDH et représentée comme une multiplication par rapport aux lignées cellulaires témoins.

Des anticorps primaires pour l'immunofluorescence ont été obtenus commercialement pour HNK1 (Sigma Adlrich), p75 (Advance Targeting Systems), FOXD3 (R&D Systems), SOX10 (R&D Systems), PHOX2B (Proteintech), DBH (Abgent) et TH (R&D Systems). Les anticorps secondaires ont été obtenus auprès de Life Technologies. Les lamelles avec des cellules colorées ont été montées dans Vectashield Hard Set contenant du DAPI (Vector Laboratories).

Toutes les données d'expression génique présentées sont des moyennes d'au moins trois expériences. Les valeurs P ont été générées par un test t unilatéral (variance inégale).

Comment citer cet article : Huang, M. et al. Génération de crête neurale du tronc à partir de cellules souches pluripotentes humaines. Sci. Rep. 6, 19727; doi : 10.1038/srep19727 (2016).

Bhatt, S., Diaz, R. & Trainor, PA Signaux et commutateurs dans la différenciation des cellules de crête neurale chez les mammifères. Cold Spring Harb Perspect Biol 5, 10.1101/cshperspect.a008326 (2013).

Green, SA, Simões-Costa, M. & Bronner, ME Évolution des vertébrés vue de la crête. Nature 520, 474–482 (2015).

ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Simões-Costa, M. & Bronner, ME Aperçu du développement et de l'évolution des crêtes neurales à partir de l'analyse génomique. Génome Res. 23, 1069-1080 (2013).

PubMed PubMed Central Google Scholar

Thisse, C., Thisse, B. & Postlethwait, JH Expression de snail2, un deuxième membre de la famille des escargots de poisson zèbre, dans le mésendoderme céphalique et la crête neurale présumée d'embryons mutants de type sauvage et spadetail. Dév. Biol. 172, 86–99 (1995).

CAS PubMed Google Scholar

Tucker, GC, Aoyama, H., Lipinski, M., Tursz, T. & Thiery, JP Réactivité identique des anticorps monoclonaux HNK-1 et NC-1 : conservation chez les vertébrés sur des cellules issues de l'ébauche neurale et sur certains leucocytes. Différence de cellule. 14, 223-230 (1984).

CAS PubMed Google Scholar

Southard-Smith, EM, Kos, L. & Pavan, WJ La mutation Sox10 perturbe le développement de la crête neurale dans le modèle de souris Dom Hirschsprung. Nat. Genet. 18, 60–64 (1998).

CAS PubMed Google Scholar

Kos, R., Reedy, MV, Johnson, RL & Erickson, CA Le facteur de transcription en hélice ailée FoxD3 est important pour établir la lignée de la crête neurale et réprimer la mélanogénèse chez les embryons aviaires. Développement 128, 1467–1479 (2001).

CAS PubMed Google Scholar

Cheung, M. & Briscoe, J. Le développement de la crête neurale est régulé par le facteur de transcription Sox9. Développement 130, 5681–5693 (2003).

CAS PubMed Google Scholar

Mitchell, PJ, Timmons, PM, Hébert, JM, Rigby, PW et Tjian, R. Le facteur de transcription AP-2 est exprimé dans les lignées cellulaires de la crête neurale au cours de l'embryogenèse de la souris. Gènes Dév. 5, 105-119 (1991).

CAS PubMed Google Scholar

Bernd, P. Apparition des récepteurs du facteur de croissance nerveuse sur les cellules de crête neurale en culture. Dév. Biol. 112, 145-156 (1985).

CAS PubMed Google Scholar

Betters, E., Liu, Y., Kjaeldgaard, A., Sundström, E. et García-Castro, MI Analyse du développement précoce de la crête neurale humaine. Dév. Biol. 344, 578-592 (2010).

CAS Google Scholar

O'Rahilly, R. & Müller, F. Le développement de la crête neurale chez l'humain. J.Anat. 211, 335–351 (2007).

PubMed PubMed Central Google Scholar

Betancur, P., Bronner-Fraser, M. & Sauka-Spengler, T. Le code génomique pour l'activation de Sox10 révèle un activateur de régulation clé pour la crête neurale crânienne. Proc. Natl. Acad. Sci. États-Unis 107, 3570–3575 (2010).

ADS CAS PubMed Google Scholar

Simões-Costa, MS, McKeown, SJ, Tan-Cabugao, J., Sauka-Spengler, T. & Bronner, ME La régulation dynamique et différentielle du facteur de cellules souches FoxD3 dans la crête neurale est cryptée dans le génome. PLoS Genet. 8, e1003142. 10.1371/journal.pgen.1003142 (2012).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Barembaum, M. & Bronner, ME Identification et dissection d'un activateur clé médiant l'expression spécifique de la crête neurale crânienne du facteur de transcription, Ets-1. Dév. Biol. 382, 567-575 (2013).

CAS PubMed Google Scholar

Tahtakran, SA & Selleck, MAJ L'expression d'Ets-1 est associée à la migration de la crête neurale crânienne et à la vasculogenèse chez l'embryon de poulet. Gène Expr. Modèles 3, 455–458 (2003).

CAS PubMed Google Scholar

Simões-Costa, M., Tan-Cabugao, J., Antoshechkin, I., Sauka-Spengler, T. & Bronner, ME L'analyse du transcriptome révèle de nouveaux acteurs dans le réseau de régulation des gènes de la crête neurale crânienne. Génome Res. 24, 281-290 (2014).

PubMed PubMed Central Google Scholar

Anderson, DJ Contrôle moléculaire du destin cellulaire dans la crête neurale : la lignée sympathosurrénale. Annu. Rév. Neurosci. 16, 129-158 (1993).

CAS PubMed Google Scholar

Schneider, C., Wicht, H., Enderich, J., Wegner, M. et Rohrer, H. Des protéines morphogénétiques osseuses sont nécessaires in vivo pour la génération de neurones sympathiques. Neurone 24, 861–870 (1999).

CAS PubMed Google Scholar

Takahashi, Y., Sipp, D. & Enomoto, H. Interactions tissulaires dans le développement et la maladie des cellules de la crête neurale. Sciences 341, 860–863 (2013).

ADS CAS PubMed Google Scholar

Fung, MM, Viveros, OH & O'Connor, DT Maladies de la médullosurrénale. Acta Physiol (Oxf) 192, 325–335.

CAS Google Scholar

Huang, M. & Weiss, WA Neuroblastome et MYCN. Cold Spring Harb Perspect Med 3, a014415. 10.1101/cshperspect.a014415 (2013).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Tischler, AS, Powers, JF & Alroy, J. Modèles animaux de phéochromocytome. Histol. Histopathol. 19, 883–895 (2004).

CAS PubMed Google Scholar

Diede, SJ et al. Différences fondamentales dans l'hyperméthylation de l'ADN des îlots CpG du promoteur entre le cancer humain et les modèles murins de cancer génétiquement modifiés. Épigénétique 8, 1254-1260 (2013).

CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Hahn, WC et al. Création de cellules tumorales humaines avec des éléments génétiques définis. Nature 400, 464–468 (1999).

ADS CAS PubMed Google Scholar

Pomp, O., Brokhman, I., Ben-Dor, I., Reubinoff, B. & Goldstein, RS Génération de neurones sensoriels périphériques et sympathiques et de cellules de crête neurale à partir de cellules souches embryonnaires humaines. Cellules souches 23, 923–930 (2005).

CAS PubMed Google Scholar

Lee, G., Chambers, SM, Tomishima, MJ & Studer, L. Dérivation de cellules de crête neurale à partir de cellules souches pluripotentes humaines. Protocole Nat 5, 688–701 (2010).

CAS PubMed Google Scholar

Chambers, SM et al. Conversion neuronale hautement efficace des cellules ES et iPS humaines par double inhibition de la signalisation SMAD. Nat. Biotechnol. 27, 275-280 (2009).

CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Menendez, L., Yatskievych, TA, Antin, PB & Dalton, S. La signalisation Wnt et un blocage de la voie Smad dirigent la différenciation des cellules souches pluripotentes humaines en cellules de crête neurale multipotentes. Proc. Natl. Acad. Sci. États-Unis 108, 19240–19245 (2011).

ADS CAS PubMed Google Scholar

Mica, Y., Lee, G., Chambers, SM, Tomishima, MJ et Studer, L. Modélisation de l'induction de la crête neurale, de la spécification des mélanocytes et des défauts de pigmentation liés à la maladie dans les hESC et les iPSC spécifiques au patient. Cell Rep 3, 1140–1152 (2013).

CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Menendez, L. et al. Différenciation dirigée des cellules pluripotentes humaines en cellules souches de la crête neurale. Nat Protocol 8, 203–212 (2013).

CAS PubMed Google Scholar

Lee, K. & Skromne, I. L'acide rétinoïque régule la taille, le motif et l'alignement des tissus à la transition tête-tronc. Développement 141, 4375–4384 (2014).

CAS PubMed Google Scholar

Lippmann, ES et al. Modélisation HOX Déterministe Dans Le Neuroectoderme Dérivé De Cellules Souches Pluripotentes Humaines. Rapports sur les cellules souches 4, 632–644 (2015).

CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Le Douarin, NM L'embryon aviaire comme modèle pour étudier le développement de la crête neurale : une histoire longue et toujours en cours. Mech. Dév. 121, 1089-1102 (2004).

CAS PubMed Google Scholar

Creuzet, S., Couly, G. & Le Douarin, NM Modélisation des dérivés de la crête neurale au cours du développement de la tête des vertébrés : aperçus des études aviaires. J.Anat. 207, 447–459 (2005).

PubMed PubMed Central Google Scholar

Huber, L., Ferdin, M., Holzmann, J., Stubbusch, J. et Rohrer, H. HoxB8 dans la spécification noradrénergique et la différenciation du système nerveux autonome. Dév. Biol. 363, 219-233 (2012).

CAS PubMed Google Scholar

Kam, MKM & Lui, VCH Rôles de Hoxb5 dans le développement des cellules de la crête neurale vagale et du tronc. Dév. Différence de croissance. 57, 158–168 (2015).

CAS PubMed Google Scholar

Creuzet, S., Couly, G., Vincent, C. & Le Douarin, NM Effet négatif de l'expression du gène Hox sur le développement du squelette facial dérivé de la crête neurale. Développement 129, 4301–4313 (2002).

CAS PubMed Google Scholar

Abzhanov, A., Tzahor, E., Lassar, AB & Tabin, CJ Régulation différente de la différenciation cellulaire dans les cellules de la crête neurale mésencéphalique (crânienne) et sacrée (tronc) in vitro. Développement 130, 4567–4579 (2003).

CAS PubMed Google Scholar

Ishikawa, S. & Ito, K. Plasticité et mécanismes de régulation de l'expression du gène Hox dans les cellules de la crête neurale de souris. Tissu cellulaire Res. 337, 381–391 (2009).

CAS PubMed Google Scholar

Huber, K. La lignée cellulaire sympathosurrénale : spécification, diversification et nouvelles perspectives. Dév. Biol. 298, 335–343 (2006).

CAS PubMed Google Scholar

Lo, L., Tiveron, MC & Anderson, DJ MASH1 active l'expression du facteur de transcription homéodomaine apparié Phox2a et couple les composants pan-neuronaux et spécifiques au sous-type de l'identité neuronale autonome. Développement 125, 609–620 (1998).

CAS PubMed Google Scholar

Koch, P., Opitz, T., Steinbeck, JA, Ladewig, J. & Brüstle, O. Une cellule souche neurale dérivée de cellules ES humaines auto-renouvelables de type rosette avec un potentiel d'instruction in vitro et d'intégration synaptique. Proc. Natl. Acad. Sci. États-Unis 106, 3225–3230 (2009).

ADS CAS PubMed Google Scholar

Kirkeby, A. et al. Génération de progéniteurs neuraux et de neurones fonctionnels spécifiés au niveau régional à partir de cellules souches embryonnaires humaines dans des conditions définies. Cell Rep 1, 703–714 (2012).

CAS PubMed Google Scholar

Chambers, SM, Mica, Y., Studer, L. & Tomishima, MJ Conversion de cellules souches pluripotentes humaines en tissu neural et en neurones pour modéliser la neurodégénérescence. Méthodes Mol. Biol. 793, 87–97 (2011).

CAS PubMed Google Scholar

Patthey, C., Gunhaga, L. & Edlund, T. Le développement précoce des systèmes nerveux central et périphérique est coordonné par les signaux Wnt et BMP. PLoS ONE 3, e1625, 10.1371/journal.pone.0001625 (2008).

Article ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Marchant, L., Linker, C., Ruiz, P., Guerrero, N. & Mayor, R. Les propriétés inductives du mésoderme suggèrent que les cellules de la crête neurale sont spécifiées par un gradient de BMP. Dév. Biol. 198, 319–329 (1998).

CAS PubMed Google Scholar

McMahon, JA et al. L'antagonisme médié par Noggin de la signalisation BMP est nécessaire pour la croissance et la structuration du tube neural et du somite. Gènes Dév. 12, 1438–1452 (1998).

CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kreitzer, FR et al. Une méthode robuste pour dériver des cellules de crête neurale fonctionnelles à partir de cellules souches pluripotentes humaines. Am J Stem Cells 2, 119-131 (2013).

CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Van Raamsdonk, CD & Deo, M. Liens entre les cellules de Schwann et les mélanocytes dans le développement et la maladie. Pigment Cell Melanoma Res 26, 634–645 (2013).

CAS PubMed Google Scholar

Massip, L. et al. L'expression de Hoxa2 dans les cellules entrant dans la chondrogenèse altère le développement global du cartilage. Différenciation 75, 256–267 (2007).

CAS PubMed Google Scholar

Shah, NM, Groves, AK & Anderson, DJ Les destins alternatifs des cellules de la crête neurale sont promus de manière instructive par les membres de la superfamille TGFbeta. Cellule 85, 331-343 (1996).

CAS PubMed Google Scholar

Reissmann, E. et al. Implication de la protéine morphogénétique osseuse-4 et de la protéine morphogénétique osseuse-7 dans la différenciation du phénotype adrénergique dans le développement des neurones sympathiques. Développement 122, 2079–2088 (1996).

CAS PubMed Google Scholar

Huber, K., Kalcheim, C. & Unsicker, K. Le développement de la lignée cellulaire chromaffine à partir de la crête neurale. Auton Neurosci 151, 10–16 (2009).

CAS PubMed Google Scholar

Bilodeau, ML, Boulineau, T., Hullinger, RL & Andrisani, OM La signalisation AMP cyclique fonctionne comme un interrupteur bimodal dans le développement des cellules sympatho-surrénales dans les cellules de crête neurale primaires cultivées. Mol. Cellule. Biol. 20, 3004–3014 (2000).

CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Télécharger les références

WAW a été soutenu par des subventions du NIH : U01U01CA176287, P30CA82103, R01NS088355, R01CA102321 et par des subventions du stand de limonade d'Alex, Katie Dougherty, Ross K. MacNeill et Samuel G. Waxman Foundations et un CureSearch Grand Challenge Award. MH a été soutenu par une bourse postdoctorale, PF-13-295-01-TBG de l'American Cancer Society et un Alex's Lemonade Stand Foundation Young Investigator Award. SI a été soutenu par la Fondation suédoise des tumeurs cérébrales et la Fondation suédoise du cancer infantile. Le MEB a été soutenu par la subvention NIH R01DE024157. Le BRC a été soutenu par des subventions du NIH : U01HL099997, P01HL089707 et R01HL060664.

Département de neurologie et Helen Diller Family Comprehensive Cancer Center, Université de Californie, San Francisco, CA 94158, États-Unis

Miller Huang, Matthew L. Miller, Lauren K. McHenry, Tina Zheng, Qiqi Zhen, Shirin Ilkhanizadeh et William A. Weiss

Départements de pédiatrie, neurochirurgie et centre de recherche sur les tumeurs cérébrales, Université de Californie, San Francisco, CA 94158, États-Unis

William A. Weiss

Gladstone Institute of Cardiovascular Disease, San Francisco, CA 94158, États-Unis

Bruce R. Conklin

Départements de médecine et de pharmacologie cellulaire et moléculaire, Université de Californie, San Francisco, San Francisco, 94143, Californie, États-Unis

Bruce R. Conklin

Division de biologie et de génie biologique, California Institute of Technology, Pasadena, 91125, Californie, États-Unis

Marianne E. Bronner

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

MH a conçu et réalisé des expériences, analysé des données et rédigé le manuscrit. MLM, LKM, TZ et QZ ont réalisé des expériences et analysé des données. SI a aidé à l'analyse statistique et à la quantification de l'immunofluorescence. BRC et MEB ont conçu des expériences et rédigé le manuscrit. WAW a supervisé l'étude et rédigé le manuscrit

Les auteurs déclarent une absence d'intérêts financiers en compétition.

Ce travail est sous licence internationale Creative Commons Attribution 4.0. Les images ou tout autre matériel tiers dans cet article sont inclus dans la licence Creative Commons de l'article, sauf indication contraire dans la ligne de crédit ; si le matériel n'est pas inclus dans la licence Creative Commons, les utilisateurs devront obtenir l'autorisation du titulaire de la licence pour reproduire le matériel. Pour voir une copie de cette licence, visitez http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/

Réimpressions et autorisations

Huang, M., Miller, M., McHenry, L. et al. Génération de crête neurale du tronc à partir de cellules souches pluripotentes humaines. Sci Rep 6, 19727 (2016). https://doi.org/10.1038/srep19727

Télécharger la citation

Reçu : 17 août 2015

Accepté : 17 décembre 2015

Publié: 27 janvier 2016

DOI : https://doi.org/10.1038/srep19727

Toute personne avec qui vous partagez le lien suivant pourra lire ce contenu :

Désolé, aucun lien partageable n'est actuellement disponible pour cet article.

Fourni par l'initiative de partage de contenu Springer Nature SharedIt

Cellule & Biosciences (2022)

Examens et rapports sur les cellules souches (2022)

Rapports scientifiques (2021)

Gènes et génomique (2021)

Recherche cellulaire et tissulaire (2021)

En soumettant un commentaire, vous acceptez de respecter nos conditions d'utilisation et nos directives communautaires. Si vous trouvez quelque chose d'abusif ou qui ne respecte pas nos conditions ou directives, veuillez le signaler comme inapproprié.

Nouvelles

Génération de crête neurale du tronc à partir de cellules souches pluripotentes humaines