ALOX15

Transduction du signal et thérapie ciblée volume 7, numéro d'article : 288 (2022) Citer cet article

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La lésion d'ischémie/reperfusion myocardique (I/R) est un type classique de maladie cardiovasculaire caractérisée par une lésion des cardiomyocytes entraînant diverses formes de mort cellulaire. On pense que des lésions myocardiques irréversibles résultant de l'I/R se produisent en raison du stress oxydatif évoqué pendant la phase de reperfusion. Ici, nous démontrons que l'ischémie déclenche une réaction redox spécifique des acides gras polyinsaturés (AGPI)-phospholipides dans les cellules myocardiques, qui agit comme une signalisation d'amorçage qui déclenche le déclenchement de dommages oxydatifs robustes dans la phase de reperfusion. À l'aide de modèles animaux et in vitro, les espèces lipidiques cruciales dans les lésions I/R ont été identifiées comme étant des AGPI oxydés enrichis en phosphatidyléthanolamines. À l'aide de multi-omiques, l'acide arachidonique 15-lipoxygénase-1 (ALOX15) a été identifié comme le principal médiateur de la peroxydation des phospholipides provoquée par l'ischémie, ce qui a été confirmé par des approches chimiogénétiques. Collectivement, nos résultats révèlent que l'induction d'ALOX15 dans la phase d'ischémie agit comme un "point de combustion" pour enflammer l'oxydation des phospholipides en signaux ferroptotiques. Cette découverte caractérise un nouveau mécanisme moléculaire pour les lésions d'ischémie myocardique et offre une cible thérapeutique potentielle pour une intervention précoce des lésions d'I/R.

Les lésions d'ischémie/reperfusion (I/R), la principale cause de lésions myocardiques,1,2,3,4 se caractérisent par une réponse inflammatoire qui endommage davantage les tissus viables autour de l'infarctus. L'ischémie (restriction du flux sanguin) et la reperfusion (restauration du flux sanguin) sont deux phases principales de la lésion I/R. Il a été largement admis que le stade de reperfusion de l'I/R plutôt que le stade d'ischémie est responsable des conséquences physiopathologiques irréparables des cellules myocardiques par une augmentation des radicaux libres d'oxygène qui déclenchent la mort cellulaire induite par le stress oxydatif.5 Cette croyance de longue date était basée sur étant entendu que la reperfusion entraîne la rentrée soudaine d'oxygène,5,6 entraînant l'exposition des tissus à des espèces réactives de l'oxygène (ROS), y compris l'anion superoxyde (O2•‒), le peroxyde d'hydrogène (H2O2) et le radical hydroxyle (HO •) entre autres. Cependant, des études plus récentes ont suggéré que les lésions oxydatives induites par la reperfusion dépendent d'événements critiques tels que l'accumulation de succinate7,8 survenant au cours de la phase d'ischémie, ce qui suggère la nécessité de mieux comprendre les changements moléculaires liés à l'ischémie. En effet, les interventions cardioprotectrices ciblant les épisodes ischémiques sont efficaces pour réduire la morbidité et la mortalité dans l'I/R.9,10 Néanmoins, les déterminants moléculaires intrinsèques des lésions ischémiques, en particulier ceux liés au stress oxydatif, restent largement inconnus.

Ces dernières années, la peroxydation des phospholipides, une réponse oxydative spécifique médiée par la lipoxygénase, a attiré beaucoup d'attention en raison de son rôle critique en tant qu'exécuteur final de la ferroptose dans de nombreuses maladies.11,12 La ferroptose est maintenant appréciée comme un type de mort cellulaire oxydative avec propriétés et fonctions distinctes, et se caractérise principalement par l'accumulation de ROS lipidiques létaux qui est initiée par la peroxydation des phospholipides ayant des chaînes d'acides gras polyinsaturés (AGPI). Jusqu'à présent, plusieurs études ont suggéré un rôle pour la ferroptose dans les lésions myocardiques pendant la reperfusion.14,15,16 Néanmoins, ces études ont ignoré la présence de peroxydation des phospholipides et de ferroptose dans l'ischémie.

Dans la présente étude, nous proposons qu'une perturbation des AGPI-phospholipides déclenche des conditions pré-oxydatives pendant la phase d'ischémie. Cela fournit un signal d'amorçage pour une épidémie de dommages oxydatifs robustes dans la phase de reperfusion. En utilisant des cellules et des animaux enrichis en AGPI, nous montrons que la lipoxygénase, l'acide arachidonique 15-lipoxygénase-1 (ALOX15) initie des réactions redox spécifiques dans les AGPI-phospholipides, ce qui augmente la sensibilité aux lésions ischémiques. Nous avons également identifié l'efficacité de la daidzéine, une molécule cardioprotectrice naturelle pour cibler ALOX15. Nos résultats fournissent de nouvelles informations sur les mécanismes pathogènes des lésions d'ischémie myocardique et identifient des cibles thérapeutiques potentielles pour le traitement précoce de l'I/R.

L'ischémie et les lésions de reperfusion sont deux phases principales qui entraînent des lésions du myocarde dans l'I/R myocardique.17 À l'heure actuelle, la plupart des études se concentrent sur les lésions des cellules myocardiques causées par une grande quantité de radicaux libres d'oxygène pendant la reperfusion. Afin d'examiner les modifications de la réaction d'oxydoréduction au cours de l'ischémie et de la reperfusion, un modèle in vitro d'hypoxie/réoxygénation (H/R) a été établi dans des cellules cardiomyocytes H9C2. Conformément aux études précédentes, les ROS communs détectés par H2DCFDA ont été produits en grande quantité dans la phase de réoxygénation mais pas dans la phase d'hypoxie (Fig. 1a). En revanche, un niveau robuste de radicaux lipidiques a été observé dans la phase d'hypoxie, indiqué par la coloration Bodipy (Fig. 1b). Cette découverte a été confirmée par coloration avec une autre sonde spécifique à l'oxydation des lipides, Liperfluo (Fig. 1c). En effet, la mort cellulaire myocardique (Fig. 1a, b supplémentaire) et les dommages cellulaires (Fig. 1d, Fig. 1c, d supplémentaires) sont déjà apparus dans la phase d'hypoxie. Ainsi, on en déduit que l'ischémie a déclenché une réaction redox lipidique dans les cellules myocardiques, ce qui pourrait potentiellement aggraver les dommages oxydatifs au stade ultérieur de la reperfusion.

La peroxydation des phospholipides est déclenchée par l'hypoxie des cardiomyocytes. a Après hypoxie/réoxygénation, les niveaux de ROS dans les cellules H9C2 ont été mesurés par coloration H2DCFDA en utilisant la cytométrie en flux à différents moments. b ROS lipidique détecté par cytométrie en flux après coloration des cellules H9C2 avec Bodipy. c ROS lipidique détecté par microscopie confocale réalisée à différentes périodes d'hypoxie dans des cellules H9C2 colorées au Liperfluo. d Teneur en CK-MB dans les cellules H9C2 après hypoxie/réoxygénation. e Analyse statistique multivariée des phospholipides oxydatifs à l'aide de l'analyse OPLS-DA entre les cellules témoins et les cellules traitées par hypoxie. Chaque point représente un échantillon (n = 7). f Carte thermique indiquant les modifications apportées aux différents oxPL dans les cellules H9C2 exposées à l'hypoxie (n = 5). g Teneur en GSH dans les cellules H9C2 traitées par hypoxie/réoxygénation. h Diagrammes de points démontrant une importance variable pour les scores de prédiction de diverses espèces d'oxPL pour distinguer les cellules H9C2 témoins des cellules traitées à l'ischémie. Les espèces PE-ox (importance variable pour le score de prédiction> 1) étaient les espèces oxydées prédominantes qui séparaient le contrôle du traitement par hypoxie (n = 7). i Effet de différents inhibiteurs de la mort cellulaire sur la cytotoxicité des cellules H9C2 exposées à une hypoxie de 4 h. Tous les inhibiteurs ont été prétraités pendant 2 h avant le traitement de l'hypoxie. Inhibiteur de la ferroptose : ferrostatine-1 (Fer-1, 1 μM), déféroxamine (DFO, 100 μM) ; inhibiteur de la nécroptose : nécrostatine-1 (Nec-1, 1 μM) ; inhibiteur de l'apoptose : Z-VAD-FMK (ZVAD, 1 μM). Effets des inhibiteurs de la ferroptose sur le contenu en GSH total (j), NADPH (k) et CK-MB (l) après 4 h d'hypoxie. La ferrostatine-1 (Fer-1, 1 μM) et la déféroxamine (DFO, 100 μM) ont été prétraitées pendant 2 h avant le traitement par hypoxie. m Une carte thermique récapitulative de l'analyse quantitative par RT-PCR des gènes liés à la ferroptose (Alox15, Ptgs2, Pla2g6, Slc7a11 et Gpx4), à l'apoptose (Bcl2 et Bax) et à la nécrose (Ripk1) dans les cellules H9C2 traitées avec une hypoxie de 4 h (n = 3). n Expressions protéiques pour ALOX15, Bax, Bcl2 et Caspase-1 dans des cellules H9C2 traitées par hypoxie/réoxygénation (n = 3). Le panneau de droite indique l'analyse statistique pour l'expression d'ALOX15. Toutes les données quantitatives sont présentées sous forme de moyenne ± SD et la signification statistique a été évaluée par ANOVA unidirectionnelle suivie d'un test post-hoc de Tukey. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001 vs groupe contrôle (suite) ; #p < 0,05, ##p < 0,01, ###p < 0,001 vs groupe hypoxie (Hyp)

Pour vérifier davantage cette découverte, les lipides oxydés dans les cellules myocardiques hypoxiques ont été identifiés à l'aide de la lipidomique redox basée sur HPLC-MS.18,19 Analyse discriminante orthogonale des moindres carrés partiels (OPLS-DA), une méthode d'analyse multivariée pour la modélisation de variables à plusieurs variables indépendantes20 ont identifié une différence distincte de produits de peroxydation des phospholipides (oxPL) entre les conditions hypoxiques et non hypoxiques des cellules myocardiques (Fig. 1e). Une analyse plus approfondie a révélé que les phosphatidyléthanolamines (PE) étaient la classe la plus prédominante de phospholipides oxydés dans les cellules hypoxiques (Fig. 1f et h). Ces résultats suggèrent que les oxPL et la ferroptose qui en résulte sont probablement impliqués dans cette phase d'hypoxie. L'accumulation d'oxPL, en particulier les PE oxydés (oxPE), est connue pour être des signaux de mort critiques et l'une des principales caractéristiques de la ferroptose.21 Pour vérifier cela, les échantillons ont été analysés pour la présence de deux indicateurs biochimiques de la ferroptose, le glutathion (GSH) et le nicotinamide adénine dinucléotide phosphate (NADPH). Les résultats ont montré que ces deux petites molécules anti-oxydantes étaient largement absentes pendant la phase d'hypoxie (Fig. 1g et Fig. 1e supplémentaire). De plus, deux inhibiteurs de la ferrostatine ferrostatine-1 (Fer-1) et déféroxamine (DFO), un inhibiteur de l'apoptose z-VAD-fmk (ZVAD) et un inhibiteur de la nécroptose nécrostatine-1 (Nec-1) ont été utilisés pour distinguer le type de la mort cellulaire induite par l'hypoxie. Comme prévu, les inhibiteurs de la ferroptose ont protégé contre la réduction de la viabilité cellulaire provoquée par l'hypoxie (Fig. 1i et Fig. 1f supplémentaire), ont inversé les niveaux de GSH (Fig. 1j) et de NADPH (Fig. 1k) et ont empêché la libération de CK-MB. (Fig. 1l). En comparaison, les inhibiteurs de l'apoptose et de la nécroptose ont présenté peu d'effet contre la mort cellulaire (Fig. 1i et Fig. 1f supplémentaire).

Ensuite, les expressions de plusieurs gènes associés à la ferroptose, l'apoptose ou la nécrose ont été examinées par reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR). Comme le montre la figure 1m, les gènes liés à l'apoptose et à la nécrose, notamment Bax, Bcl-2, Ripk1 et Caspase3, n'ont pas été affectés par l'hypoxie. D'autre part, les niveaux d'ARNm des régulateurs de la ferroptose, notamment Alox15, Alox12, Alox5, Ptgs2, Pla2g6, Slc7a11 et Gpx4, ont augmenté ou diminué (Fig. 1m). Parmi ces changements, l'expression de la lipoxygénase ALOX15 était la plus évidente, ce qui a également été confirmé par Western blot (Fig. 1n). Prises ensemble, ces données illustrent que la peroxydation des phospholipides est une caractéristique essentielle de la phase d'hypoxie des cellules myocardiques et que la voie de mort cellulaire ferroptotique a déjà été initiée pendant l'hypoxie.

Étant donné que l'augmentation des AGPI à la position bis-allylique du phospholipide est un facteur déterminant de la peroxydation et de la ferroptose, 22 un modèle cellulaire enrichi en AGPI a été établi en incubant des cellules H9C2 avec de l'acide linoléique (LA, Fig. 2a). Des cellules enrichies en acide oléique (OA) ont été utilisées comme témoins d'acides gras monoinsaturés (MUFA) (Fig. 2a). L'impact des acides gras sur la viabilité cellulaire a été déterminé, sur la base duquel les conditions de traitement pour LA et OA (80 μM, 12 h) ont été choisies (Fig. 2a, b supplémentaires). La coloration Oil Red O a montré que LA et OA ont été incorporés avec succès dans les cellules (Fig. 2c supplémentaire). Comme prévu, la provocation LA a amélioré la sensibilité des cellules myocardiques à la mort induite par l'hypoxie (Fig. 2c), à la peroxydation lipidique (Fig. 2d), à la déplétion en GSH (Fig. 2e) et à l'élévation de la CK-MB (Fig. 2f). Contrairement aux cellules enrichies en PUFA, les cellules enrichies en MUFA ont eu peu d'impact sur ces paramètres. Ces résultats impliquent que l'augmentation des AGPI aggrave en effet la lésion induite par l'hypoxie des cellules myocardiques.

Les PUFA-PE oxydés servent de signaux de mort cruciaux pour les lésions myocardiques induites par l'ischémie. un schéma expérimental pour l'établissement de cellules MUFA ou enrichies en PUFA. Les cellules H9C2 ont été traitées avec de l'acide oléique (OA, 80 μM) ou de l'acide linoléique (LA, 80 μM) pendant 12 h. AGMI, acides gras monoinsaturés ; UFA, acides gras insaturés. b Schéma illustrant l'établissement d'un modèle animal d'ischémie chez des rats nourris avec un régime normal (ND, contenant 36,335 g/kg d'UFA) ou un régime riche en graisses (HFD, contenant 243,45 g/kg d'UFA). Après 8 semaines d'alimentation, les rats ont été soumis à une ischémie par ligature de l'artère coronaire descendante antérieure gauche (LAD). Après avoir induit une hypoxie dans les cellules traitées avec des PUFA ou des MUFA préparés par BSA, la mort cellulaire ( c ) et la peroxydation lipidique ( d ) ont été, respectivement, évaluées avec une coloration PI et Liperfluo suivie d'une cytométrie en flux. Le traitement BSA a été défini comme groupe témoin. Teneur totale en GSH (e) ou CK-MB (f) dans les cellules enrichies en PUFA/MUFA lors d'un traitement par hypoxie de 4 h. g Le diagramme de nuage de pluie montre le contenu des changements Log10 (moyenne) des AGPI totaux dans le cœur des rats nourris au ND et au HFD (n = 5). h Le graphique radar indique les changements de SFA, MUFA et PUFA dans le cœur des rats nourris au ND et au HFD. L'augmentation relative de ces acides gras a été représentée par un graphique à barres (n = 5). i Les OxPL ont été extraits et interprétés par analyse en composantes principales (ACP), et les tracés de score 2D affichent les répertoires des rats ND-sham, ND-LAD et HFD-LAD. Chaque point représente un échantillon et les ellipses représentent des régions de confiance à 95 % (n = 5). j Le graphique en haltères montre différents types d'oxPE dans le contenu des modifications Log10 (moyenne) chez les rats ligaturés LAD nourris avec ND ou HFD (n = 5). k Parcelles volcaniques montrant les modifications des oxPL dans le tissu cardiaque de rats ligaturés LAD avec alimentation ND et HFD (n = 5). La signification de -log10 (valeur P) par le test t. La teneur en GSH (l) et en NADPH (m) a été détectée chez des rats nourris au ND ou au HFD après une ligature LAD de 24 h. Toutes les données quantitatives sont présentées sous forme de moyenne ± SD et la signification statistique a été évaluée par ANOVA unidirectionnelle suivie d'un test post-hoc de Tukey. Pour les expériences in vitro, *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001 vs groupe témoin BSA ; #p < 0,05, ##p < 0,01, ###p < 0,001 vs groupe hypoxie (Hyp). Pour les expériences in vivo, ***p < 0,001 vs groupe "ND + sham", #p < 0,05, ###p < 0,001 vs groupe "ND + LAD"

Pour déterminer si l'augmentation des AGPI est pertinente in vivo, des modèles animaux enrichis en AGPI ont été établis chez des rats Wistar traités par voie antérieure descendante gauche (LAD) en nourrissant un régime riche en graisses contenant des AGPI (PUFA-HFD) pendant 8 semaines (Fig. 2b, Supplément Fig. 2d–m). Les résultats ont montré que l'exposition aux PUFA-HFD induisait un déplacement des AGPI totaux, mis en évidence par l'analyse du tracé des nuages ​​de pluie (Fig. 2g). Le graphique radar a indiqué que l'alimentation PUFA-HFD a entraîné une augmentation d'environ 3% des PUFA et une chute d'environ 6% des MUFA (Fig. 2h). Par la suite, une analyse lipidomique redox basée sur LC-MS / MS a été réalisée dans les tissus cardiaques en les soumettant à une ligature LAD dans un régime normal (ND) et des rats nourris au HFD, avec des substances standard internes comme contrôle de qualité (Fig. 3 supplémentaire et Fig. 3 supplémentaire). . 4). Un total de 410 espèces de phospholipides individuels, dont 339 phospholipides non oxygénés et 71 oxygénés, ont été détectés. De plus, l'analyse en composantes principales (ACP), une procédure mathématique qui diminue la dimensionnalité des données tout en préservant la majorité de la variance dans l'ensemble de données en la transformant en composantes principales à l'aide d'une transformation orthogonale,23 a indiqué que les variables oxPLs pouvaient être distinguées entre ND et HFD groupes (Fig. 2i). Les phospholipides oxydés ont été analysés qualitativement et semi-quantitativement et cinq grandes classes de phospholipides oxygénés, y compris les PE, les phosphatidylcholines (PC), les phosphatidylsérines (PS), les phosphatidylglycérols (PG), les phosphatidylinositols (PI) et les cardiolipines (CL) ont été identifiées (Fig. 2k ). Curieusement, parmi ces phospholipides oxydés, les oxPE, qui ont été impliqués comme signal de mort cellulaire spécifique à la ferroptose, 22, 24 ont été les plus significativement modifiés et ont été identifiés comme étant le principal contributeur à la différence totale (Fig. 2j, k, Supplémentaire figure 5a).

De manière inattendue, les rats nourris avec des PUFA-HFD ont montré une sensibilité significative à l'ischémie myocardique, manifestée par une mortalité plus élevée (Fig. 5b supplémentaire), une fonction cardiaque détériorée (Fig. 5c – i et 5k-l supplémentaires) et des dommages pathologiques aggravés (Fig. 5j). L'alimentation en PUFA-HFD a également eu un impact significatif sur les paramètres liés à la peroxydation des lipides, notamment la diminution de la teneur en GSH (Fig. 2l) et en NADPH (Fig. 2m) et l'élévation du taux de malondialdéhyde (MDA) (Fig. 5m supplémentaire) dans les tissus cardiaques après Ligature LAD. Ces données mettent en évidence la pertinence de la ferroptose déclenchée par les PE oxydés et des lésions myocardiques induites par l'ischémie.

Pour identifier les acteurs moléculaires de la régulation de la peroxydation des phospholipides au cours de l'ischémie myocardique, une analyse ARN-seq a été réalisée dans les tissus cardiaques de rats ischémiques simulés et LAD-ligature. L'analyse de l'enrichissement génétique pour les expressions géniques différentielles a révélé que les voies liées au métabolisme étaient largement affectées (Fig. 6a supplémentaire). Des modifications apparentes des gènes ont également été notées dans les voies liées à la membrane, au composant intégral de la membrane plasmique, au processus d'oxydo-réduction ou à la réponse à l'hypoxie (Fig. 6b supplémentaire). Notamment, certains gènes différentiels se chevauchaient à travers la ferroptose, la membrane et les voies métaboliques (Fig. 3b). Ensuite, des gènes de pointe enrichis dans les voies métaboliques entre les cœurs fictifs et ischémiques ont été examinés pour révéler qu'ALOX15, une enzyme centrale dans la peroxydation des phospholipides et la ferroptose, était fortement régulée à la hausse au niveau de l'expression génique et des protéines dans des conditions d'ischémie (Fig. 3a, c). Il convient de noter que l'expression de plusieurs gènes marqueurs impliqués dans l'apoptose, la nécrose et l'autophagie n'a pas été affectée par l'ischémie (Fig. 3c et Fig. 6c supplémentaire). Comme prévu, l'ischémie induite par la ligature LAD a augmenté les niveaux de gènes et de protéines d'ALOX15, et HFD a augmenté ce changement (Fig. 3d, e).

L'expression d'ALOX15 est fortement corrélée aux lésions cardiomyocytaires induites par l'ischémie/hypoxie. a–c L'analyse différentielle des gènes dans les tissus cardiaques des cœurs fictifs et ischémiques. a Les parcelles de volcan expriment les gènes différentiellement exprimés entre les deux groupes dans les voies métaboliques par analyse KEGG. Les gènes régulés positivement (point rouge) ou régulés négativement (point bleu) au moins la valeur absolue de log2 (changement de facteur)> 1 et P <0, 05 ont été définis comme seuils entre deux traitements (n = 4). b Le graphique Circos indique des gènes différentiels qui se chevauchent à travers la ferroptose, la membrane et les voies métaboliques. En dehors du Circos, chaque arc représente une liste de gènes de voie d'identité, et à l'intérieur, un point sur l'arc représente un gène. Plus le nombre de liens violets est élevé et plus les arcs orange foncé sont longs, ce qui implique un chevauchement plus important entre les listes de gènes d'entrée. Alox15, Acls4 et G6pd ont été identifiés comme les gènes chevauchants de trois voies. c Carte thermique des expressions différentielles des gènes classiques liés à la ferroptose (Hmox-1, Alox15, Ptgs2, Acsl4), à l'apoptose (Bax, Bcl2, Bik, Bak1), à la nécrose (Ripk3, Mlkl, Ripk1) et à l'autophagie (Atg4b, Atg2a , Ulk2, Atg5, Ulk1, Map1lc3b, Map1lc3a). Les échelles de couleur montrent les différences d'expression de chaque gène dans l'échantillon indiqué par rapport à son expression en log2 (fold change). Les niveaux d'ARNm ( d ) et de protéines ( e ) d'ALOX15 dans les tissus cardiaques de rats nourris au ND ou au HFD après une ligature LAD de 24 h et la semi-quantification sont indiqués dans le panneau inférieur. f Après si-Alox15, la peroxydation lipidique a été détectée par microscopie confocale après coloration au Liperfluo dans des cellules H9C2 enrichies en PUFA sous hypoxie. L'effet de l'inhibiteur d'ALOX15 PD 146176 (PD, 10 μM) sur la mort cellulaire (g) et la teneur en GSH (h) a été évalué par coloration PI dans des cellules H9C2 enrichies en PUFA sous hypoxie. Après surexpression d'Alox15 (Alox15 OE) dans des cellules H9C2 enrichies en PUFA sous hypoxie, la peroxydation lipidique (i), la mort cellulaire (j) et la teneur en GSH (k) ont été respectivement déterminées par microscopie confocale, cytométrie en flux et HPLC-MS. Toutes les données quantitatives sont présentées sous forme de moyenne ± SD et la signification statistique a été évaluée par ANOVA unidirectionnelle suivie d'un test post-hoc de Tukey. Pour les expériences in vitro, *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001 vs groupe témoin (Cont) ; #p < 0,05, ##p < 0,01, ###p < 0,001 vs groupe hypoxie (Hyp). Pour les expériences in vivo, *p < 0,05, **p < 0,01 vs groupe "ND + sham", #p < 0,05, ##p < 0,01 vs groupe "ND + LAD"

Pour établir une corrélation directe entre la peroxydation des phospholipides médiée par ALOX15 et l'ischémie myocardique, des inhibiteurs d'ALOX15 (PD 146176 et baicaleine) et des approches de gain de fonction et de perte de fonction ont été utilisés dans les cellules H9C2. Dans les cellules normales ou les cellules enrichies en PUFA, l'inhibition d'ALOX15 a fourni une protection contre la mort cellulaire (Fig. 3g), tandis que la surexpression d'ALOX15 a exacerbé la population de cellules colorées par PI (Fig. 3j). D'autre part, l'inhibition ou l'inactivation d'ALOX15 (Fig. 6d supplémentaire) a pu non seulement limiter la mort cellulaire et la peroxydation lipidique (Fig. 3f, Fig. 6e, f supplémentaires), mais également augmenter la teneur en GSH (Fig. 3h) dans les cellules enrichies en PUFA. Inversement, la surexpression d'Alox15 par transfection de plasmide (Fig. 6d supplémentaire) a montré une régulation opposée de la peroxydation lipidique (Fig. 3i et Fig. 6g supplémentaire) et du niveau de GSH (Fig. 3k). Ces résultats illustrent un rôle important pour ALOX15 dans la peroxydation des phospholipides provoquée par l'ischémie/hypoxie et les dommages aux cardiomyocytes qui en résultent.

Pour vérifier le rôle essentiel d'ALOX15 dans les lésions myocardiques induites par l'ischémie, un modèle d'ischémie a été établi par traitement à l'isoprotérénol (ISO) chez des souris Alox15–/– et WT enrichies en AGPI (Fig. 4a). Pour la préparation d'animaux enrichis en PUFA, du LA (2 g/kg) a été administré par voie intragastrique à des souris pendant 2 semaines. Après la provocation LA, les animaux ont reçu une injection intrapéritonéale de 40 mg/kg d'ISO pour induire une ischémie. Les souris enrichies en AGPI ont montré une sensibilité accrue aux lésions myocardiques induites par l'ischémie, représentées par une survie réduite (Fig. 4b), une fonction cardiaque exaspérée (Fig. 4c, d) ainsi que des taux sériques élevés d'isoenzyme de créatine kinase-MB (CK- MB), la lactate déshydrogénase (LDH) et l'aspartate aminotransférase (AST) (Fig. 4g – i). Conformément aux cardiocytes exposés à l'hypoxie, nous avons en outre fourni une preuve in vivo démontrant l'impossibilité pour l'ischémie d'induire l'apoptose et la nécrose dans un modèle animal établi par ISO (Fig. 7 supplémentaire). De manière notable, les lésions myocardiques augmentées en AGPI chez les souris ISO ont été abolies chez les souris Alox15–/–. Les images échocardiographiques ont présenté une fonction cardiaque récupérée chez les souris knock-out Alox15, avec une réduction significative du% EF et du% FS par rapport aux souris témoins PUFA (Fig. 4c, d). En parallèle, la libération favorisée par les AGPI d'enzymes liées à la fonction myocardique dans le sang a également été sauvée par un déficit en ALOX15 (Fig. 4g – i). L'insensibilité des souris Alox15–/– à l'ischémie était liée à la peroxydation des phospholipides comme déduit par l'observation que chez le rat l'ischémie induite par LAD. Le traitement par PUFA a également appauvri le NADPH et le GSH dans les tissus cardiaques des souris injectées par ISO, ce qui a été abrogé par l'inactivation d'Alox15 (Fig. 4e, f). De plus, un modèle OPLS-DA construit à l'aide de profils oxPLs pour discriminer différents groupes (Fig. 4j) a révélé que les souris Alox15–/– et les souris WT pouvaient être distinguées sur la base non seulement des oxPLs, mais également de différents traitements au sein du même génotype de souris. Cela indique que les oxPL induits par le traitement ISO sont sensibles au régime riche en graisses et à la perturbation d'ALOX15. Parmi les 45 PE oxydés détectés, PE (36: 4) + 2 O, PE (38: 4) + 2 O et PE (36: 2) + 2 O, ont été nettement améliorés dans les cœurs enrichis en AGPI de souris WT (Fig. . 4k). En revanche, l'inactivation d'Alox15 a aboli l'augmentation conférée par les AGPI des PE oxydés (Fig. 4k). Prises ensemble, ces données suggèrent la pertinence in vivo d'un rôle central pour la peroxydation des phospholipides médiée par ALOX15 dans la susceptibilité médiée par les AGPI à l'ischémie myocardique.

Les souris Alox15–/– perdent la sensibilité induite par les AGPI aux lésions myocardiques induites par l'ischémie. a Schéma expérimental d'établissement d'un modèle animal d'ischémie chez des souris enrichies en AGPI en WT ou Alox15–/–. Tous les animaux ont reçu de l'AL (2 g/kg, 14 jours) par voie intragastrique, puis de l'isoprotérénol (ISO) injecté par voie intrapéritonéale, 40 mg/kg. Les tissus cardiaques ont été obtenus un jour après l'injection ISO. b Influence des AGPI sur le taux de survie des souris WT avec traitement ISO (ip, 40 mg/kg). *p < 0,05 par test du Log-rank (Mantel-Cox) (n = 8). c et d Effet des AGPI sur la fonction cardiaque de souris WT ou Alox15–/– avec traitement ISO. c Images d'échocardiographie représentatives. d La fraction d'éjection ventriculaire gauche (EF%) et la fraction de raccourcissement ventriculaire gauche (FS%). Le contenu de NADPH (e) et de GSH (f) a été détecté dans les tissus cardiaques de souris WT ou Alox15–/– injectées ISO. Les niveaux d'enzymes myocardiques, y compris CK-MB (g), LDH (h) et AST (i) ont été analysés dans les tissus cardiaques de souris WT ou Alox15–/– injectées ISO. j Les graphiques de score OPLS-DA analysent la séparation des oxPL oxydés entre les souris WT et Alox15–/–. Chaque point représente un échantillon (n = 4–5). k Données quantitatives pour les espèces de PE dioxygénées, y compris PE (36:4), PE (38:4) et PE (36:2) dans les tissus cardiaques de souris WT ou Alox15–/– injectées ISO. Toutes les données quantitatives sont présentées sous forme de moyenne ± SD et la signification statistique a été évaluée par une ANOVA unidirectionnelle suivie d'un test post-hoc de Tukey (d – i) ou d'un test t (k). *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001 vs le groupe « WT + PUFA » ; #p < 0.05, ##p < 0.01, ###p < 0.001 vs groupe "WT + ISO". &p < 0,05, &&p < 0,01, &&&p < 0,001 vs groupe "Alox15–/–+PUFA" ; △p < 0,05, △△p < 0,01, △△△p < 0,001 vs groupe "WT + PUFA + ISO"

Compte tenu de l'importance de la lipoxygénase ALOX15 dans les lésions ischémiques, une analyse d'amarrage moléculaire avec ALOX15 a été réalisée en utilisant plus de 40 000 produits naturels. En utilisant cette approche, la daidzéine a été identifiée avec une affinité de liaison exceptionnelle. La daidzéine forme des liaisons hydrogène intermoléculaires avec les résidus d'acides aminés de His361 et Gln548 et a des interactions hydrophobes avec Glu357, His361, His366, Ala404, Leu408, Met419 et Ile593 dans ALOX15 (Fig. 5a). Fait intéressant, His361 avait à la fois des liaisons hydrogène intermoléculaires et des effets hydrophobes (Fig. 5a). Par la suite, nous avons effectué un essai de déplacement thermique cellulaire (CETSA) et avons constaté que la daidzéine atténuait le taux de dégradation d'ALOX15 avec l'augmentation de la température (Fig. 5b). L'affinité de liaison de la daidzéine et de la lipoxygénase a été confirmée à l'aide du test de thermophorèse à micro-échelle (MST) (Fig. 5c) qui a révélé que la daidzéine inhibait considérablement l'activité d'ALOX15 (Fig. 5d). Ainsi, ces données ont identifié la daidzéine comme un puissant inhibiteur d'ALOX15.

La daidzéine, un inhibiteur naturel d'ALOX15, empêche les lésions myocardiques induites par l'ischémie. a Images d'amarrage représentatives d'ALOX15 et de daidzéine. b et c L'affinité de liaison de la daidzéine et de l'ALOX15 a été déterminée par les expériences CETSA et MST. CETSA a été réalisée dans les lysats de cellules HEK293T surexprimant ALOX15 (b). Les données sont exprimées en moyenne ± SD, et la signification statistique a été analysée par ANOVA à deux voies suivie du test post-hoc de Tukey. *p < 0,05 vs le groupe DMSO. Les points de données dans l'analyse MST indiquent la différence de fluorescence normalisée (‰) générée par la liaison de la daidzéine à ALOX15, et les courbes montrent les ajustements calculés (c). d Le taux d'inhibition de la daidzéine sur l'activité enzymatique ALOX15. Les données sont exprimées en moyenne ± SD, et la signification statistique a été analysée par ANOVA unidirectionnelle suivie du test post-hoc de Tukey. *p < 0,05 par rapport au groupe d'activité initiale (AI). Effet de la daidzéine sur la teneur en CK-MB (e) et l'expression des protéines (f) dans les cellules hypoxiques H9C2. La daidzéine (50 μM) a été prétraitée pendant 12 h. Les données sont exprimées en moyenne ± SD, et la signification statistique a été analysée par ANOVA unidirectionnelle suivie du test post-hoc de Tukey. ***p < 0,001 vs groupe témoin (suite) ; ###p < 0,001 vs groupe hypoxie (Hyp). g–k Effet de la daidzéine sur les fonctions cardiaques et les modifications histologiques des souris WT ou Alox15–/– nourries au HFD et soumises à l'ISO. g Images d'échocardiographie. h Teneur en CK-MB sérique. i La fraction d'éjection ventriculaire gauche (EF%) et la fraction de raccourcissement ventriculaire gauche (FS%). j taux sérique d'AST. k Examen anatomopathologique H&E de coupes cardiaques (n = 3). Les données sont exprimées en moyenne ± SD, et la signification statistique a été analysée par ANOVA unidirectionnelle suivie du test post-hoc de Tukey. ***p < 0,001 vs groupe "WT + HFD", #p < 0,05, ###p < 0,001 vs groupe "WT + ISO" ; &&p < 0,01, &&&p < 0,001 vs groupe "Alox15–/–+HFD" ; △p < 0,05, △△△p < 0,001 vs groupe "WT + HFD + ISO"

L'effet protecteur de la daidzéine a d'abord été examiné in vitro et les résultats ont montré qu'il réduisait significativement le niveau de CK-MB (Fig. 5e) et supprimait l'expression d'ALOX15 (Fig. 5f) dans les cellules myocardiques exposées à l'hypoxie. De plus, la daidzéine a présenté des propriétés remarquables d'antioxydant (Fig. 8 supplémentaire). Pour vérifier davantage l'effet de la daidzéine in vivo, 40 mg/kg de daidzéine ont été administrés par voie intragastrique pendant 4 semaines à des souris Alox15–/– ou WT nourries avec HFD. Il a été constaté que le traitement à la daidzéine inversait nettement les lésions ischémiques induites par le traitement PUFA-HFD et ISO, comme l'indique l'amélioration de la fonction cardiaque (Fig. 5g, i), la réduction des enzymes myocardiques chez les souris (Fig. 5h, j) et l'atténuation des changements pathologiques ( Fig. 5k) dans les tissus cardiaques de souris WT. L'effet protecteur de la daidzéine sur les lésions myocardiques a été aboli chez les souris Alox15–/– (Fig. 5g – k). Pris ensemble, il est conclu que la daidzéine, un inhibiteur naturel d'ALOX15, a un potentiel pour le traitement des lésions ischémiques, et le ciblage d'ALOX15 fournit une stratégie d'intervention précoce pour le traitement de l'I/R.

Depuis la découverte des effets létaux des lésions de reperfusion, un intérêt passionné s'est consacré au développement de stratégies pour prévenir les lésions de reperfusion, et l'importance de la phase ischémique dans ce processus a été largement ignorée. Bien que la zone de lésion myocardique diminue de manière significative après la reconstruction par reperfusion, elle entraîne toujours des lésions irréversibles sur au moins 25 % des cellules myocardiques.17 Il est maintenant de plus en plus reconnu que le degré de lésion ischémique pourrait prédire et déterminer la lésion de reperfusion suivante. 7,17,25 En effet, les interventions cardioprotectrices appliquées lors des épisodes ischémiques, y compris l'hypothermie thérapeutique9 et le perconditionnement ischémique à distance,10 sont efficaces pour réduire la morbidité et la mortalité dans l'I/R. Néanmoins, les déterminants moléculaires intrinsèques des lésions ischémiques restent largement inconnus. Dans la présente étude, l'analyse transcriptomique combinée à des validations fonctionnelles en série a révélé qu'une enzyme clé dans l'oxydation des AGPI-phospholipides, ALOX15, était induite par l'ischémie/hypoxie. Nous avons également démontré que la contribution d'ALOX15 aux lésions ischémiques dépendait de son activité peroxydante bien établie qui se traduit par une accumulation d'oxPEs avec apparition ultérieure de ferroptose. Cette découverte surprenante détourne l'attention des radicaux libres courants vers la réponse oxydative spécifique médiée par la lipoxygénase, renversant ainsi l'opinion de longue date selon laquelle les dommages oxydatifs ne se présentent qu'au stade de la reperfusion.

L'inflammation est depuis longtemps reconnue comme l'un des mécanismes critiques de la lésion d'ischémie myocardique26 et ALOX15 a un impact significatif sur l'inflammation via la production de médiateurs lipidiques. nous excluons la possibilité d'une inflammation au stade précoce de l'ischémie, ce qui est étayé par des études antérieures montrant une réponse inflammatoire significative déclenchée seulement jusqu'à 3 jours après la ligature LAD.28,29 Cette découverte soulève la possibilité que la peroxydation médiée par ALOX15 des PUFA-phospholipides , qui est plus précoce que la formation des précurseurs inflammatoires, est un élément initial crucial dans le mécanisme pathologique de la lésion ischémique.

Pendant des décennies, l'apport d'AGPI a été considéré comme bénéfique pour la fonction cardiaque.30,31,32 Récemment, les chercheurs ont progressivement réalisé que l'avantage des AGPI dans la prévention des lésions myocardiques pouvait être surestimé dans certaines circonstances.33,34,35 En particulier , un essai contrôlé randomisé à grande échelle étudiant les effets des oméga-3 marins, un type d'AGPI sur les résultats cardiovasculaires, a révélé un risque accru de fibrillation auriculaire.36 Ces preuves cliniques inattendues soulèvent la nécessité de découvrir les aspects les plus néfastes des AGPI dans les maladies cardiovasculaires maladies. Plus intrigant, il a été rapporté que l'augmentation des AGPI dans le plasma des patients obèses était bien corrélée aux lésions myocardiques.37 Conformément à cette observation clinique et à un rapport antérieur chez l'animal,38 nos résultats ont révélé qu'une composition reconstituée d'acides gras dans les cardiomyocytes de tissus cardiaques de souris nourries avec HFD, a entraîné une augmentation des AGPI et une diminution des AGMI. Nous avons en outre déterminé que les animaux/cellules enrichis en AGPI étaient sujets à des lésions d'ischémie/hypoxie dues à l'induction d'ALOX15. Notre étude, pour la première fois, fournit un lien de causalité entre l'apport en AGPI et les dommages de l'ischémie myocardique médiés par la peroxydation des phospholipides induite par ALOX15.

L'implication de diverses formes de mort cellulaire des cardiomyocytes, telles que l'apoptose, la nécroptose et la pyroptose dans les lésions I / R, a été traditionnellement reconnue.39,40 Par exemple, l'autophagie s'est avérée induite 8 jours après la ligature LAD,41 s'est produite 4 semaines après la ligature LAD.42 La nécrose a tendance à se produire dans la phase de reperfusion de l'I/R.43 Néanmoins, dans notre étude, il a été prouvé que l'ischémie à court terme avait peu d'impact sur l'apoptose et la nécrose dans les ischémies ISO et LAD. des modèles. Contrairement à ces types classiques de mort cellulaire, nous mettons au jour le rôle essentiel de la ferroptose dans la phase d'ischémie de l'I/R. En raison du rôle central de la réponse oxydative dans les lésions I/R, l'association entre la ferroptose et la fonction cardiaque a sans aucun doute attiré beaucoup d'attention. Il a été récemment rapporté que la ferritine H/SLC7A11 favorise la ferroptose dans la cardiomyopathie,44 et que les chélateurs du fer préviennent les lésions d'ischémie-reperfusion du myocarde.15,16 Bien que ces études aient soulevé des inquiétudes quant à la façon dont la ferroptose affecte la physiopathologie de l'I/R au niveau moléculaire, ils se sont principalement concentrés sur les perturbations en phase de reperfusion. Les données présentées ici se sont concentrées sur la phase d'ischémie de l'I/R démontrant sans équivoque que l'induction d'ALOX15 déclenche l'oxydation des PUFA-phospholipides, en particulier des PUFA-PE conduisant à la ferroptose des cardiomyocytes. Nous pensons donc qu'il s'agit d'un signal d'amorçage qui augmente les dommages oxydatifs robustes dans la phase de reperfusion.

Bien qu'il y ait eu de nombreuses tentatives pour développer de nouvelles thérapies contre l'I/R, ces effets ont été contrecarrés par les limites de la disponibilité de médicaments efficaces. À cet égard, nos découvertes sur le rôle d'ALOX15 en tant que cible thérapeutique potentielle des lésions ischémiques ont conduit à l'identification de la daidzéine en tant qu'inhibiteur puissant d'ALOX15, qui s'avère prometteur dans le traitement des deux phases des lésions I/R. Récemment, de plus en plus de recherches ont été consacrées au développement de nouveaux biomarqueurs cliniques des lésions myocardiques45,46,47 et à la promotion d'un diagnostic précoce de l'I/R.48,49,50 Il est prédictif que la découverte de régulateurs clés au stade de l'ischémie, tels que ALOX15, nous identifié dans la présente étude, peut également contribuer à l'exploitation de biomarqueurs pour le diagnostic précoce de l'I/R.

Une question en suspens reste à répondre est celle de savoir comment ALOX15 dans les tissus cardiaques ischémiques. En réponse à l'ischémie, la synthèse cellulaire des protéines, en particulier celles liées à la réaction d'oxydo-réduction, est activée pour coordonner diverses sorties biologiques et affiner les réponses au stress hypoxique. Avant notre étude, il y a eu des observations cliniques indiquant une expression élevée d'ALOX15 dans les cœurs ischémiques aigus et à long terme des patients.51,52 Pendant ce temps, ALOX15 a également été signalé comme étant abondamment exprimé dans les macrophages en condition d'hypoxie.53,54 de plus, des expressions améliorées parallèles du facteur 1 inductible par l'hypoxie (HIF-1) et d'ALOX15 dans des échantillons cliniques de cœur ischémique impliquaient que la transcription d'ALOX15 pourrait être associée à HIF-1.55 Néanmoins, cette conclusion nécessite des preuves plus directes et convaincantes dans de futures investigations.

En résumé, la présente étude a utilisé des modèles in vivo et in vitro enrichis en AGPI pour récapituler la peroxydation des phospholipides et la ferroptose comme caractéristiques essentielles des lésions myocardiques induites par l'ischémie. L'induction d'ALOX15 a été identifiée comme un déterminant du facteur sensible dans l'ischémie induite par les AGPI. Ces découvertes, y compris l'identification de la daidzéine en tant qu'inhibiteur, ouvrent de nouveaux horizons dans la compréhension de la pathogenèse des lésions ischémiques, ouvrant la voie au développement de stratégies thérapeutiques précoces dans l'I/R.

Des cellules H9C2 de la lignée cellulaire de myoblastes cardiaques de rat (American Type Culture Collection, Manassas, Virginie, États-Unis) ont été cultivées dans du DMEM riche en glucose additionné de 10 % (v/v) de FBS, de pénicilline G (100 U/ml) et de streptomycine (100 unités μg/ml), sous 5 % de CO2 à 37 °C.

Pour établir un modèle d'ischémie in vitro, des cellules H9C2 ont été placées dans la chambre d'incubateur modulaire d'ischémie (Billups-Rothenberg Inc, États-Unis), remplie de gaz mixte (5 % de CO2 et 95 % de N2). Les cellules dans cette chambre ont été cultivées à 37 ° C pendant 4 h.

Des cellules enrichies en PUFA ont été préparées comme décrit précédemment.56 En bref, des cellules H9C2 ont été étalées dans des boîtes et cultivées pendant 24 h dans un milieu complet (DMEM, 10 % de FBS) contenant 80 μM de LA conjugué à la BSA.

Des rats Wistar mâles (Laboratory Animal Center, Southern Medical University, Guangzhou, Chine) pesant 120 à 130 g ont été maintenus dans une pièce à température contrôlée avec des cycles lumière-obscurité de 12 h: 12 h. Ils ont eu accès gratuitement à un HFD (40 % de glucides, 20 % de protéines et 40 % de matières grasses par calories) ou à un ND (70 % de glucides, 20 % de protéines et 10 % de matières grasses par calories) pendant huit semaines.

Des souris Alox15–/– ont été achetées auprès de Jackson Laboratory (stock n° 002778) et des souris C57BL/6 J de type sauvage ont été obtenues auprès de Laboratory Animal Center, Southern Medical University. Ces animaux ont été maintenus en groupe et hébergés dans des conditions exemptes d'agents pathogènes. Chaque souris a reçu une alimentation standard de 3 g/jour et de l'eau potable à volonté. Le Comité des animaux de laboratoire de l'Université de Jinan a approuvé toutes les expérimentations animales (n° 2019358).

La chirurgie de ligature des artères coronaires LAD a été utilisée pour établir un modèle d'ischémie myocardique selon des études précédentes. et 2 % d'isoflurane ont été maintenus tout au long de l'opération. Un angiocathéter de calibre 14 a été appliqué pour l'intubation endotrachéale et connecté à une ventilation mécanique (RWD Life Science Co., Ltd, Shenzhen, Chine). Le système d'électrocardiogramme animal (ECG) (PowerLab Multiconductor Physiograph, ADInstruments Ltd., Australie) a été utilisé pour surveiller la fonction cardiaque des rats. La thoracotomie a été réalisée au niveau du quatrième espace intercostal gauche et le cœur a été ligaturé de manière permanente autour de l'artère interventriculaire antérieure gauche à 2 mm sous l'oreillette gauche avec des sutures en polypropylène 6-0. L'ischémie a été vérifiée par un segment ST élevé à l'ECG et un changement de couleur dans le tissu myocardique de la zone ischémique. L'incision de thoracotomie a été fermée en couches et le tube endotrachéal a été retiré. La buprénorphine (0,5 mg/kg) a été utilisée pour contrôler la douleur postopératoire.

Les cœurs de rats ont été récoltés et perfusés dans une solution saline de tampon phosphate après une période de ligature LAD de 24 h. Ces tissus ont été congelés à –20 °C pendant 30 min, coupés transversalement en quatre sections de 2 mm d'épaisseur chacune, incubés avec 2 % de chlorure de triphényltétrazolium (TTC ; Aladdin, Shanghai, Chine) dans une solution de phosphate pendant 10 min à 37 °C , puis fixé par du paraformaldéhyde à 10 % pendant 24 h. Le tissu non coloré révèle la zone infarcie, tandis que le tissu coloré au TTC de couleur rouge représente la région non infarcie. Ces sections ont été photographiées numériquement et la taille de l'infarctus a été analysée à l'aide d'ImageJ et exprimée en pourcentage de la zone infarcie par rapport à la zone non infarcie, comme décrit précédemment.58,59

Chaque souris Alox15–/– et WT C75BL/6 J a reçu par voie intragastrique 50 mg d'AL chaque jour. La quantité d'AL était fonction de l'apport quotidien de calories égales de 110 g de matières grasses pour 60 kg d'humain.60 Deux semaines plus tard, des souris ont reçu 40 mg/kg d'ISO par injection intrapéritonéale pour induire une ischémie myocardique.

L'échocardiographie a été utilisée pour détecter la fonction cardiaque de rats ou de souris ischémiques. Pendant l'essai, l'anesthésie des animaux a été maintenue par inhalation d'isoflurane à 2 %. L'échocardiographie a été réalisée à l'aide d'un Visual Sonics Vevo 2100 (VisualSonics, Canada) en mode M. La fonction cardiaque a été obtenue à partir d'axes longs et courts au niveau des muscles papillaires dans le parasternal. De plus, la dimension télédiastolique du ventricule gauche (VG), la dimension télésystolique du VG (LVD), l'épaisseur du septum interventriculaire à la diastole (IVSd) et l'épaisseur de la paroi postérieure du VG à la diastole (LVPWd) ont été calculées pour la fraction d'éjection (EF%) , raccourcissement fractionnaire (FS%) et masse ventriculaire gauche.

Les cœurs récoltés à partir de souris ou de rats ischémiques ont été fixés dans du paraformaldéhyde à 4 % pendant la nuit, tamponnés avec du PBS 1x, déshydratés dans de l'éthanol par étapes et transférés sur du xylène avant d'être inclus dans de la paraffine. Les tissus inclus en paraffine ont été coupés en sections de 4 µm et les changements histologiques ont été examinés par coloration de Masson (Leagene Biotech Co., Ltd., Pékin, Chine) et coloration H&E (Beyotime Biotech Co., Ltd., Shanghai, Chine). ). Ces modifications histologiques ont été visualisées et analysées au microscope à balayage (PreciPoint, Allemagne).

Récoltées à la densité de 10 × 106, les cellules H9C2 ont été colorées avec H2DCFDA (MedChemExpress, Chine) pour détecter le niveau de ROS, et colorées avec Bodipy (BODIPY™ 581/591 C11, Invitrogen, USA) ou Liperfluo (Dojindo, Shanghai, Chine) pour détecter le niveau de peroxydation lipidique. Les signaux ont été collectés par cytométrie en flux (CytoFLEX S équipé de l'analyse Kaluza 2.1, Beckman Couter, USA) ou imagés par un microscope confocal à balayage laser Olympus FV3000 (Olympus, Japon).

La préparation et l'analyse des phospholipides ont été décrites précédemment.18 Les phospholipides ont été analysés par LC-MS à l'aide d'un système HPLC Dionex Ultimate 3000 couplé à un spectromètre de masse Q-Exactive Hybrid Quadripole-Orbitrap (Thermo Fisher Scientific) à l'aide d'une colonne de phase normale (Luna 3 μm) Silice (2) 100 Å, 150 × 2,0 mm, (Phenomenex). La température de la colonne a été fixée à 35°C. L'analyse a été réalisée à l'aide de gradients de solvants (A et B) contenant 10 mM de formiate d'ammonium à un débit de 0,2 mL/min. Le solvant A contenait de l'isopropanol/hexane/eau (285 : 215 : 5, V/V/V) et le solvant B contenait de l'isopropanol/hexane/eau (285 : 215 : 40, V/V/V). Tous les solvants étaient de qualité LC/MS. Le programme d'élution en gradient a été défini comme suit : 0 min, 10 % B ; 23 min, 32 % ; 32 minutes, 65 % ; 35 minutes, 100 % ; 70 minutes, 100 %. L'analyse a été effectuée en mode ions négatifs à une résolution de 70 000 pour le balayage MS complet et de 17 500 pour le balayage MS2 en mode dépendant des données. La plage de balayage pour l'analyse MS était m/z 400–1800 avec un temps d'injection maximum de 200 ms en utilisant 1 microscan. La tension de pulvérisation capillaire a été fixée à 3,0 kV et la température capillaire était de 320 °C. Le niveau Rf de la lentille S a été défini sur 60. Un temps d'injection maximal de 500 ms a été utilisé pour l'analyse MS2 (dissociation collisionnelle à haute énergie) avec une énergie de collision définie sur 24. Une fenêtre d'isolement de 1,0 Da a été définie pour le MS et le MS2. scans.

Les pics avec un rapport signal sur bruit supérieur à trois ont été identifiés et recherchés dans une base de données interne de phospholipides oxydés. Les valeurs de m/z ont été appariées à moins de 5 ppm pour identifier l'espèce lipidique. Les lipides ont ensuite été filtrés par temps de rétention et confirmés par analyse MS2 avec les fragments utilisés pour leur identification (https://www.lipidmaps.org/). L'analyse quantitative est basée sur des courbes d'étalonnage générées par des quantités connues d'étalons de référence et ses étalons internes correspondants, y compris CL(16:0/18:2/18:2/20:4), PC(18:1/18:1) , PE(18:1/18:1), PG(18:1/18:1), PI(18:1/18:1), PS(18:1/18:1), CL(14:0 /14:0/14:0/14:0), PC(16:0-d31/18:1), PE(16:0-d31/18:1), PG(16:0-d31/18 : 1), PI(16:0-d31/18:1), PS(16:0-d31/18:1). La position sn des chaînes acyle dans PL a été attribuée en fonction des intensités des anions carboxylate et des fragments de perte de chaîne acyle sn-2 sous forme de cétène (R2CH=C=O) dans les spectres MS/MS.61,62

Les cellules ont été cultivées sur des boîtes à la densité de 10 × 106. Après l'établissement de l'ischémie, 0,05 mg/mL d'iodure de propidium (PI) (Sigma) ont été ajoutés pour colorer les cellules mortes et analysés par cytométrie en flux (CytoFLEX S équipé de l'analyse Kaluza 2.1, Soc Beckman, États-Unis).

L'ARN total du tissu de l'infarctus a été isolé à partir de rats témoins et de rats chirurgicaux LAD après une période de lésion myocardique de 24 h. La pureté des échantillons a été détectée par un spectrophotomètre (NanoPhotometer®IMPLEN, CA, USA). 2100 RNA Nano 6000 Assay Kit (Agilent Technologies, CA, USA) a été utilisé pour détecter l'intégralité de l'ARN comme contrôle qualité. Les ADNc de transcription inverse ont été séquencés dans le kit de réactifs Novaseq 6000 S4 v1.5 sur une plateforme Novaseq 6000 S4. Les DEG significatifs ont été criblés à l'aide des données de comptage de lecture de l'expression génique dans chaque échantillon obtenu par quantification de l'expression avec le logiciel DESeq2. Les changements de pli dans les niveaux d'expression entre les échantillons ont été utilisés comme critères dans le processus de sélection. Après avoir fusionné les DEG de deux traitements, des analyses de clustering ont été effectuées à l'aide de Cluster 3.0 et de Java TreeView. L'outil DAVID et l'outil Metascape ont été appliqués à l'analyse et à la visualisation de gènes différentiellement exprimés.

Les cellules ont été étalées et cultivées à 60% de confluence et transfectées pendant 24 h avec 100 nM d'ARNsi ciblés sur ALOX15 ou d'ARNsi de contrôle négatif à l'aide du réactif Lipofectamine 2000 (Invitrogen) conformément au protocole du fabricant. Les siARN ont été achetés auprès de GenePharma (Shanghai, Chine). Les séquences pour Alox15 étaient GGAUGUGUCAGGAUACCUUTT (sens), AAGGUAUCCUGACAUCCTT (anti-sens); CCAGAAAGGGCACUCUGUUUTT (sens), AAACAGAGUGCCUUUCUGGTT (antisens); GCUUUACACCAUGGAAAAUUTT (sens); AAUUUCCAUGGUGUAAAGCTT (anti-sens). Les séquences de contrôle négatif étaient UUCUCCGAACGUGUCACGUTT (sens), ACGUGACACGUUCGGAGAATT (anti-sens). Western blot a été utilisé pour vérifier l'effet du silençage génique. Une combinaison de trois séquences d'ARNsi (1:1:1) a été appliquée dans ces expériences.

Pour la surexpression d'ALOX15, les cellules ont été étalées dans une plaque à 6 puits à une densité de 4,0 × 106 et transfectées avec pAAV-CMV-Alox15-3xFlag ou un vecteur vide (VectorBuilder, Guangzhou, Chine) en utilisant le réactif de transfection d'ADN NEOFECT (Pékin, Chine) . Six heures plus tard, le milieu complet a été changé pour une autre culture de 24 h. La surexpression d'ALOX15 a été confirmée par analyse Western blot.

Des extraits protéiques d'échantillons cellulaires ou animaux ont été préparés sur de la glace par un tampon RIPA (Beyotime, Shanghai Chine) contenant des inhibiteurs de protéase et de phosphatase. Les lysats protéiques ont été séparés par électrophorèse sur gel de dodécylsulfate de sodium-polyacrylamide et transférés sur une membrane PVDF de 0, 45 μm ou 0, 22 μm (Merck Millipore, Billerica, MA, USA). Les protéines transférées ont été incubées avec des anticorps primaires contre ALOX15 (ab244205, Abcam), Bax (2772 S, Cell Signaling Technology), Bcl2 (2870, Cell Signaling Technology), caspase-1 (SC-56036, Santa Cruz) et GAPDH (FD0068 , Fdbio Science, Hangzhou, Chine), suivi d'une incubation avec des anticorps secondaires conjugués à la peroxydase de raifort (HPR) (FDR007/FDM007, Fdbio science, Hangzhou, Chine). Après avoir été sondé par le kit ECL (Fdbio science, Hangzhou, Chine), le niveau d'expression des protéines a été visualisé sous Tanon 5200 Chemiluminescence Image Analysis System (Tanon Science & Technology, Shanghai, Chine). Les semi-quantifications des expressions protéiques ont été analysées à l'aide d'ImageJ (NIH, USA).

TRIzol (Invitrogen) a été utilisé pour extraire l'ARN total des tissus cardiaques ou des échantillons de cellules selon le protocole du fabricant. L'ARN a été transcrit de manière inverse en ADNc à l'aide de TransScript® One-Step gDNA Removal et cDNA Synthesis SuperMix (Transgen, Pékin, Chine). TransStart® Top Green qPCR SuperMix (Transgen, Pékin, Chine) a été utilisé pour effectuer une PCR quantitative conformément aux instructions du fabricant. Les signaux ont été détectés et analysés sur CFX Connect System (Bio-rad, USA). GAPDH ou β-actine a été utilisé comme contrôle standard et les séquences d'amorces ont été répertoriées dans le tableau supplémentaire 1.

Les enzymes myocardiques AST, LDH et CK-MB ont été considérées comme des valeurs diagnostiques cliniques. En conséquence, le sang a été prélevé sur des souris dans des tubes EP par une méthode d'énucléation oculaire. Le sang dans le tube EP a été centrifugé à 3 000 tr/min pendant 15 min jusqu'au sérum. Les enzymes myocardiques dans le sérum ont ensuite été déterminées à l'aide de l'analyseur chimique AU680 (Beckman Couter, USA). La viscosité du sang total a été analysée par un rhéomètre sanguin automatique LBY-N7500B (Precil, Pékin, Chine).

Les cellules ont été réparties dans des plaques à 96 puits avec une densité de 5 × 103. Après les traitements, 20 μL de solution de MTT à 5 mg/ml ont été ajoutés aux cellules et incubés pendant 4 h. Le formazan produit a été dissous dans 150 μL de DMSO et détecté par un système de microplaque multifonctionnel (Multiskan MK3, Thermo Fisher Scientific) à une absorbance de 490 nm.

Les cellules ont été réparties dans des plaques à 6 puits avec une densité de 10 × 106. Après les traitements, le surnageant de culture a été collecté pour détecter la libération de LDH à l'aide d'un kit disponible dans le commerce. Pour la mesure SOD/MDA/NADPH, les cellules ont été lysées par la méthode de congélation-décongélation répétitive et le surnageant a été utilisé pour déterminer l'activité de SOD et les niveaux de MDA et NADPH par des kits commerciaux. Tous les essais ont été strictement conduits dans les conseils des manuels de kit. Les kits LDH, SOD et MDA ont été achetés auprès de Beyotime Co., Ltd. (Shanghai, Chine) et le kit NADPH provenait de Comin Biotechnology Co., Ltd. (Suzhou, Chine).

Le GSH dans les tissus cardiaques (10 mg) a été préparé par une méthode d'extraction méthanol-eau comme décrit précédemment.63 En bref, des solutions ultrasoniques de tissus cardiaques ont été recueillies avec une proportion égale de méthanol et d'eau à 4 °C. La solution a été extraite à l'aide de 500 μL de dichlorométhane et le liquide supérieur retenu a été centrifugé à 14 000 tr/min pendant 25 min à 4 °C. Après séchage à l'azote, les échantillons ont été dissous dans 200 μL de méthanol-eau à 50 %, centrifugés à 14 000 tr/min pendant 25 min à 4 °C à nouveau et analysés par HPLC-MS (Thermo Fisher Scientific).

La coloration Oil Red O a été réalisée pour détecter l'accumulation de lipides dans les cellules enrichies en PUFA et enrichies en MUFA. Après traitement, les cellules ont été lavées deux fois avec du PBS et fixées avec le réactif A dans le kit Oil Red O (Shanghai Yuanye Bio-Technology Co., Ltd., Shanghai, Chine) à température ambiante pendant 20 min, puis colorées avec le réactif B pendant 15 min. Ensuite, les cellules ont été rincées avec de l'isopropanol à 60 % et les noyaux ont été contre-colorés avec le réactif C pendant 2 min. Après lavage avec le réactif D pendant 1 min, les images des cellules colorées ont été acquises par un microscope inversé IX51 (Olympus, Tokyo, Japon).

La capacité de piégeage des radicaux libres de la daidzéine (Chroma-Biotechnology Co., Ltd., Chengdu, Chine) a été testée par une méthode ORAC comme décrit précédemment.64 En bref, le dichlorhydrate de 2,2'-azobis(2-méthylpropionamidine) (AAPH, un générateur de radicaux libres), du sodium de fluorescence (Sigma, MO, USA, excitation/émission de sonde de fluorescence à 485/535 nm) et du Trolox (capteur de radicaux libres) ont été utilisés. Dans ce système de réaction, 20 μL de PBS 75 mM, 20 μL de daidzéine, 20 μL de fluorescéine et 140 μL d'AAPH ont été inclus. La fluorescence a été mesurée toutes les 2 min pendant 2 h à l'aide d'un lecteur de microplaques TECAN GENios Luciferase (Männedorf, Suisse) à 37 °C. La valeur d'ORAC a été calculée comme la surface nette sous la courbe de décroissance de la fluorescence en utilisant Trolox comme étalon d'étalonnage.

Au total, 40271 molécules de la bibliothèque de composés naturels de Topscience et MedChemExpress ont été ancrées avec ALOX15 (PDB ID : 1LOX) par le module libdock du logiciel Discovery Studio (version 3.5). L'amarrage flexible de 10 000 molécules correspondantes sélectionnées (score supérieur à 120) à chaque site de liaison potentiel sur ALOX15 a été réalisé à l'aide du module CDOCKER, acquérant 212 composés correspondants (score supérieur à 25). Enfin, sur la base du regroupement structurel et de l'analyse des modèles de liaison, la daidzéine a été sélectionnée comme inhibiteur potentiel d'ALOX15 avec le meilleur score.

CETSA a été réalisée dans les lysats de cellules HEK293T surexprimant ALOX15. Après transfection pendant 24 h, les cellules ont été collectées et congelées-décongelées sous azote liquide, et les lysats cellulaires ont été dilués avec du PBS et divisés en deux aliquotes, une aliquote étant ajoutée avec de la daidzéine (50 μM) et l'autre comme contrôle DMSO. Après incubation à 37 °C pendant 1 h, tous les lysats ont été chauffés à différentes températures de 41 à 73 °C pendant 3 min, suivi d'un refroidissement à température ambiante. Tous les échantillons ont été centrifugés à 4 °C et les fractions solubles ont été soumises à une analyse Western blot.

La daidzéine a été diluée avec du tampon MST (HEPES 50 mM, NaCl 150 mM, MgCl2 10 mM, Tween-20 0,05 %, pH 7,0) à 1 mM. La lipoxygénase de soja (L7395, Sigma, Chine) a été marquée par un kit de marquage de protéines de deuxième génération Monolith NTTM RED-NHS basé sur le manuel (NanoTemper Technologies GmbH, Munich Allemagne) et diluée avec un tampon MST à 100 nM. Le mélange de daidzéine et d'ALOX15 marqué a été incubé à température ambiante pendant 30 min et leur affinité de liaison a été analysée par thermophorèse à l'échelle microscopique (NanoTemper Monolith Instrument NT.115). Le laser rouge a été absorbé par des solutions aqueuses mixtes de différentes concentrations dans 12 capillaires. La fluorescence a été déterminée dans un gradient thermique à 40 % de puissance MST avec des temps d'arrêt/marche du laser de 5 à 20 s, et les données ont été analysées par MO Affinity Analysis v2.3.

Les données sont présentées sous forme de moyenne ± SD. Le cas échéant, la normalité a été estimée à l'aide du test de Levene. P > 0,05 a été considéré comme conforme à la distribution normale. Pour la comparaison entre 2 groupes, le test t pour échantillons indépendants a été utilisé lorsque les données présentaient une distribution normale et le test de Mann-Withney a été utilisé lorsque les données ne suivaient pas la distribution normale. Pour plus de 2 groupes, les données de distribution normale ont été analysées par ANOVA à un facteur avec comparaison multiple de la Turquie, et les données de distribution non normale ont été analysées par le test Post Hoc avec T3 de Dunnentt. (SigmaStat, SPSS Inc., Chicago, Illinois, États-Unis). La comparaison des courbes de survie a été analysée statistiquement par le test Log-rank (Mantel-Cox). P < 0,05 était considéré comme statistiquement significatif.

Les auteurs déclarent que les données à l'appui des conclusions de cette étude sont disponibles dans l'article et ses documents supplémentaires. Toutes les données générées au cours de cette étude sont incluses dans cet article publié et ses fichiers d'informations supplémentaires. Toutes les données de cette étude sont disponibles auprès de l'auteur correspondant sur demande raisonnable.

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Ce travail a été soutenu, en partie, par le programme national clé de recherche et de développement de Chine (2017YFC1700400, 2017YFC1700404, 2022YFC0867400), Natural Science Foundation of China (82125038, 81904068, 81873209, U1801284, 81903821, 82174 054), les Equipes Locales d'Innovation et de Recherche Projet du Guangdong Pearl River Talents Program (2017BT01Y036), GDUPS (2019), Fondation des sciences naturelles du Guangdong (2019A1515010909, 2021A1515011297), Programme scientifique et technologique de Guangzhou (201903010062, 907158833068) et Projet d'équipe d'innovation du Département provincial de l'éducation du Guangdong (2020KCXTD003). Les auteurs (RR He et YF Li) remercient également le soutien de KC Wong Education Foundation.

Guangdong Engineering Research Center of Chinese Medicine & Disease Susceptibility, Jinan University, Guangzhou, 510632, Chine

Xiao-Hui Ma, Jiang-Han-Zi Liu, Chun-Yu Liu, Wan-Yang Sun, Wen-Jun Duan, Hiroshi Kurihara, Rong-Rong He et Yi-Fang Li

Guangdong Province Key Laboratory of Pharmacodynamic Constituents of TCM and New Drugs Research, College of Pharmacy, Jinan University, Guangzhou, 510632, Chine

Xiao-Hui Ma, Jiang-Han-Zi Liu, Chun-Yu Liu, Wan-Yang Sun, Wen-Jun Duan, Hiroshi Kurihara, Rong-Rong He et Yi-Fang Li

Laboratoire coopératif international de modernisation de la médecine traditionnelle chinoise et de développement de médicaments innovants du ministère chinois de l'Éducation (MOE), Université de Jinan, Guangzhou, 510632, Chine

Xiao-Hui Ma, Jiang-Han-Zi Liu, Chun-Yu Liu, Wan-Yang Sun, Wen-Jun Duan, Hiroshi Kurihara, Rong-Rong He et Yi-Fang Li

Institut de médecine traditionnelle chinoise, Université médicale du Xinjiang, Urumqi, 830054, Chine

Xiao Hui Ma

Innovation Center of Nursing Research, Nursing Key Laboratory of Sichuan Province, State Key Laboratory of Biotherapy and Cancer Center, West China Hospital, Sichuan University, Chengdu, 610041, Chine

Guan Wang

Collège de pharmacie, Université de médecine chinoise de Guangzhou, Guangzhou, 510405, Chine

Yang Chen

Laboratoire clé de médecine interne chinoise du ministère de l'Éducation, Hôpital Dongzhimen, Université de médecine chinoise de Pékin, 100700, Pékin, Chine

Hongcai Shang

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RRH a conçu et supervisé l'ensemble du projet. HS, YC, YFL et HK ont consulté et conseillé le projet. YFL, RRH et YC ont révisé le manuscrit. XHM a conçu et réalisé la majorité des études in vitro et in vivo. XHM a analysé les données et rédigé le manuscrit. JHZL et CYL ont fourni une assistance dans les expériences in vitro. WYS a participé à la détection et à l'analyse de la phospholipidomique. WJD a fourni des conseils sur l'analyse des données et la représentation graphique. GW a effectué l'analyse d'amarrage moléculaire. Tous les auteurs ont lu et approuvé l'article.

Correspondance avec Rong-Rong He, Yi-Fang Li, Yang Chen ou Hongcai Shang.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

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Réimpressions et autorisations

Ma, XH., Liu, JHZ., Liu, CY. et coll. La peroxydation des PUFA-phospholipides lancée par ALOX15 augmente la sensibilité à la ferroptose dans les lésions myocardiques induites par l'ischémie. Sig Transduct Target Ther 7, 288 (2022). https://doi.org/10.1038/s41392-022-01090-z

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Reçu : 08 mars 2022

Révisé : 2 juin 2022

Accepté : 26 juin 2022

Publié: 15 août 2022

DOI : https://doi.org/10.1038/s41392-022-01090-z

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