Un mécanisme de rétroaction inadapté entre la matrice extracellulaire et le cytosquelette contribue à la physiopathologie de la cardiomyopathie hypertrophique

Communications Biology volume 6, Article number: 4 (2023) Citer cet article

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La cardiomyopathie hypertrophique est une maladie héréditaire due à des mutations des protéines contractiles qui se traduit par un myocarde raide et hypercontractile. Pour comprendre le rôle de la rigidité cardiaque dans la progression de la maladie, nous créons ici un modèle in vitro de cardiomyopathie hypertrophique utilisant la technologie de l'hydrogel. La culture de myocytes cardiaques de type sauvage sur des hydrogels avec un module de Young (raideur) imitant le myocarde de cardiomyopathie hypertrophique est suffisante pour induire un état mitochondrial hypermétabolique par rapport aux myocytes plaqués sur des hydrogels simulant un myocarde sain. De manière significative, ces données reflètent celles des myocytes isolés d'un modèle murin de cardiomyopathie hypertrophique humaine (cTnI-G203S). Inversement, la fonction mitochondriale des myocytes cTnI-G203S est complètement restaurée lorsqu'elle est plaquée sur des hydrogels imitant un myocarde sain. Nous identifions un mécanisme de rétroaction mécanosensible entre la matrice extracellulaire et le réseau cytosquelettique qui régule la fonction mitochondriale dans des conditions saines, mais participe à la progression de la physiopathologie de la cardiomyopathie hypertrophique résultant de mutations du gène sarcomérique. Il est important de noter que nous identifions les sites clés de «liaison» dans ce schéma qui peuvent représenter des cibles thérapeutiques potentielles.

La cardiomyopathie hypertrophique (CMH) est une cardiopathie génétique autosomique dominante qui touche 1 : 500 de la population générale1. C'est la première cause de mort cardiaque subite chez les jeunes (5-15 ans)2. La HCM survient principalement en raison de mutations génétiques dans les protéines sarcomériques3,4. Les caractéristiques cliniques de la CMH comprennent l'hypertrophie ventriculaire gauche en l'absence d'augmentation de la charge hémodynamique et un ventricule gauche non dilaté avec une fraction d'éjection préservée ou augmentée1,4. Au niveau cellulaire, la CMH se caractérise par un remodelage des myocytes cardiaques, une désorganisation des protéines sarcomériques, une fibrose interstitielle et un métabolisme énergétique altéré5. Nous avons précédemment identifié un rôle pour le canal calcique cardiaque de type L (LTCC) dans le développement de la physiopathologie de la CMH6,7.

Le LTCC cardiaque déclenche une « libération de calcium induite par le calcium » qui est essentielle au maintien du couplage excitation-contraction cardiaque8. Le LTCC cardiaque joue également un rôle important dans la régulation de la fonction mitochondriale via des mécanismes calcium-dépendants et calcium-indépendants9,10. Plus précisément, l'activation du LTCC évoque une augmentation du potentiel de membrane mitochondriale (Ψm), en présence ou en l'absence de calcium9. Ceci est facilité par une association structurale-fonctionnelle entre le canal et les mitochondries. Le LTCC cardiaque est une protéine transmembranaire composée de sous-unités α1C, α2δ et β2. La sous-unité β2 est liée à la sous-unité α1C porogène via le domaine d'interaction α (AID)11. La sous-unité β2 s'associe également à la protéine AHNAK associée à la différenciation des neuroblastes, également connue sous le nom de desmoyokine, une grande protéine sous-sarcolemmique, qui est également ancrée à la F-actine12. Les protéines du cytosquelette, y compris la F-actine, interagissent directement avec les mitochondries en se liant aux protéines d'amarrage mitochondriales externes13,14,15. Ce lien structurel entre le LTCC et les mitochondries joue un rôle important dans la régulation de la fonction mitochondriale dans des conditions physiologiques, avec des changements conformationnels qui se produisent dans la sous-unité LTCC β2 battement par battement entraînant des altérations en aval de la fonction mitochondriale9.

Les altérations de ce réseau intracellulaire sont associées à une dérégulation de la fonction mitochondriale et au développement d'états pathologiques6,7,16,17. Nous avons précédemment montré qu'un modèle murin de HCM humaine provoquant la mutation du gène de la troponine I (cTnI) Gly203Ser (cTnI-G203S) présente une architecture cytosquelettique perturbée, une communication structurelle-fonctionnelle altérée entre le LTCC et les mitochondries, et un état mitochondrial hypermétabolique résultant6,17 . Des résultats similaires ont été enregistrés chez des souris porteuses de la maladie humaine provoquant la mutation de la chaîne lourde de la β-myosine Arg403Gln7. Notamment, ces réponses ont précédé le développement de l'état hypertrophique.

Le phénotype HCM humain établi est caractérisé par un myocarde raide18,19. Dans cette optique, l'augmentation de la synthèse des protéines de la matrice extracellulaire (ECM) a été impliquée dans la progression de la pathologie HCM humaine20,21,22. En effet, les tissus cardiaques modifiés créés en ensemençant des myocytes cardiaques sains dérivés de cellules souches pluripotentes induites par l'homme sur des bandes de myocarde décellularisé récoltées à partir d'un modèle porcin de HCM présentent une rigidité accrue21. L'ECM interagit avec les myocytes cardiaques via l'intégrine protéique mécanodétectrice transmembranaire, qui a également été impliquée dans le développement de l'hypertrophie cardiaque23,24. La vinculine, une protéine cytosolique, assure la liaison de l'intégrine à l'actine F et transfère les forces mécaniques de la membrane cellulaire au cytosquelette23,25,26. Par conséquent, en plus d'un réseau intracellulaire entre le LTCC et les mitochondries, une association structurale-fonctionnelle semble également exister entre l'ECM et la F-actine. Ici, nous explorons le rôle de ce lien dans le développement de la physiopathologie HCM impliquant le LTCC et les mitochondries en créant une plate-forme in vitro qui imite la rigidité myocardique HCM.

Nous avons cherché à développer un modèle in vitro de cardiomyopathie hypertrophique. Nous avons commencé par évaluer les modules de Young compressifs (rigidité) des hydrogels produits pour imiter le myocarde sain ("doux") et HCM ("raide"). En utilisant la microscopie à force atomique, la rigidité globale en compression des hydrogels a été enregistrée à 12, 5 ± 0, 4 et 34, 1 ± 0, 9 kPa respectivement (p <0, 05, Fig. 1b). Nous avons ensuite utilisé une lignée cellulaire de myoblastes H9C2 isolée à partir de tissu ventriculaire de rat, pour tester notre plateforme in vitro. Les cellules H9C2 ont été étalées sur des substrats d'hydrogel recouverts de laminine de protéine ECM. Les cellules H9C2 plaquées sur des hydrogels rigides ont affiché une augmentation significative de la rigidité en compression par rapport aux hydrogels mous (p <0, 05, Fig. 1a supplémentaire). De plus, des études d'immunohistochimie ont révélé une augmentation significative de la lamine A, un marqueur cellulaire de la rigidité, ainsi que de la vinculine, une protéine mécanodétectrice (p <0, 05, Fig. 1b – e supplémentaire) 27, 28, 29. Ces données indiquent que la modification de la rigidité en compression de la plate-forme d'hydrogel était suffisante pour modifier la rigidité des cellules.

a Schéma indiquant le lien structurel-fonctionnel entre le canal calcique de type L, le réseau cytosquelettique et les mitochondries dans les myocytes cardiaques wt. Sites de liaison ciblés (1) domaine d'interaction α du canal calcique de type L (AID), (2) site d'interaction entre la sous-unité β2 du canal calcique de type L et AHNAK, (3) F-actine, (4) β-tubuline, et (5) l'intégrine β1. b Rigidité à la compression (en kPa) des hydrogels de polyacrylamide (PA) dans des conditions de fabrication (souples et rigides), y compris moyenne ± SEM. c Rigidité à la compression (en kPa) des myocytes cardiaques wt plaqués sur des hydrogels souples et rigides, y compris la moyenne ± SEM. Images représentatives et points de données quantifiés pour les myocytes cardiaques wt plaqués sur des hydrogels mous et rigides colorés pour lamin A (d, e), la vinculine (f, g) et l'intégrine (h, i), y compris la moyenne ± SEM. n = nombre de cellules, N = nombre d'hydrogels. Signification statistique déterminée par les tests de Mann Whitney.

Ensuite, nous avons réalisé des études sur des myocytes cardiaques isolés de souris de type sauvage (wt) âgées de 10 à 15 semaines. Les myocytes étalés sur des substrats d'hydrogel souples et rigides recouverts de laminine ont donné des rigidités d'environ 2 et 4 kPa respectivement (p <0, 05, Fig. 1c). Il est important de noter que ces valeurs correspondent aux mesures précédemment rapportées de la rigidité myocardique évaluées chez des adultes en bonne santé et HCM âgés de 20 à 40 ans18. Les myocytes étalés sur des hydrogels rigides présentaient également une augmentation significative de la lamine A, de la vinculine et de l'intégrine β1, l'isoforme d'intégrine la plus abondamment exprimée dans le cœur postnatal23,30 (p <0, 05, Fig. 1d – i). Ces données indiquent que notre plateforme in vitro est adéquatement représentative de la condition humaine.

Nous avons précédemment démontré que les myocytes cardiaques cTnI-G203S présentent une activité métabolique mitochondriale accrue et un Ψm compatible avec la condition humaine31, en réponse à l'activation du LTCC6,17. Ici, nous avons exploré si le simple placage de myocytes cardiaques wt sur des hydrogels avec une rigidité imitant le myocarde HCM était suffisant pour refléter ces réponses. Nous avons testé l'effet de la rigidité du substrat sur l'activité métabolique mitochondriale et Ψm dans des myocytes cardiaques isolés de souris wt âgées de 10 à 15 semaines, en réponse à l'activation du LTCC à l'aide de l'agoniste du canal BayK(-). L'activité métabolique dépend de la consommation d'oxygène et du transport d'électrons mitochondrial le long de la chaîne de transport d'électrons. Par conséquent, nous avons mesuré les altérations du transport d'électrons mitochondrial dans des myocytes cardiaques intacts plaqués sur des hydrogels mous et rigides pendant au moins 3 h, en surveillant les changements dans l'oxydation des flavoprotéines (comme autofluorescence). Nous avons constaté que les myocytes wt plaqués sur des hydrogels mous et rigides présentaient tous deux une augmentation significative de l'oxydation des flavoprotéines après exposition à BayK (-) par rapport à l'énantiomère (+) de BayK qui n'agit pas comme un agoniste (BayK (+)) (Fig. 2a–c). Cependant, l'ampleur de la réponse BayK(-) était significativement plus grande sur les hydrogels rigides que sur les hydrogels mous. Il est important de noter que toutes les réponses induites par BayK (-) pourraient être atténuées par l'application de la nisoldipine, un antagoniste du LTCC, confirmant que le LTCC a médié la réponse. Ces données indiquent que les altérations de la rigidité de l'ECM sont suffisantes pour modifier la régulation de la fonction mitochondriale par le LTCC.

Flavoprotéine ratiométrique représentative (a, b) et fluorescence JC-1 (e, f) enregistrée à partir de myocytes cardiaques wt plaqués sur des hydrogels mous et rigides avant et après exposition à 10 μM BayK(+) ou 10 μM BayK(-) dans le absence ou présence de nisoldipine (15 μM, Nisol). Les études JC-1 ont été réalisées dans des conditions sans calcium (calcium 0 mM). Les flèches indiquent l'ajout de médicaments. Pour confirmer que les signaux étaient d'origine mitochondriale, du FCCP (50 μM) a été appliqué à la fin de chaque expérience de flavoprotéine pour augmenter l'oxydation des flavoprotéines. NaCN (40 mM) a été appliqué à la fin de chaque expérience JC-1 pour effondrer Ψm. Fluorescence globale des flavoprotéines (c) et JC-1 (d) pour tous les myocytes (n) exposés aux médicaments, comme indiqué, y compris la moyenne ± SEM. fluorescence d–h, flavoprotéine (d) et JC-1 (h) pour les myocytes cardiaques (n, en suspension) isolés de souris cTnI-G203S cardiomyopathiques et homologues wt après exposition à BayK(+) ou 10 μM BayK(−)17 . Toute signification statistique déterminée par les tests de Kruskal-Wallis ou le test ANOVA de Browne-Forsythe et Welch (i).

Afin d'examiner l'effet de la rigidité du substrat sur la communication structurale-fonctionnelle entre le canal et les mitochondries, nous avons également évalué les altérations de Ψm dans des conditions sans calcium. Bien que la phosphorylation oxydative soit un processus dépendant du calcium, Ψm reste fortement polarisé dans des conditions de faible calcium intracellulaire (0–535 nM)32,33. En effet, des études réalisées sur des myocytes cardiaques de souris et de cobaye démontrent que l'activation du LTCC par voltage-clamp de la membrane plasmique, application d'une solution à haut K+ ou BayK(−), entraîne une augmentation de Ψm, même en l'absence de calcium9 . La dépolymérisation de l'actine ou de la β-tubuline avec la trunculine A ou la colchicine, ou l'absence de dystrophine, atténue le Ψm élevé indiquant que la réponse dépend d'une architecture cytosquelettique intacte6,7,9,16. Ici, conformément aux altérations observées dans l'oxydation des flavoprotéines, nous avons constaté que les myocytes wt plaqués sur des hydrogels mous et rigides, incubés pendant au moins 3 h dans du HBS sans calcium et contenant de l'EGTA, affichaient tous deux une augmentation significative de Ψm après l'application de BayK(− ) par rapport à BayK (+) (Fig. 2e – g). Encore une fois, l'ampleur de la réponse BayK(-) était significativement plus grande sur les hydrogels rigides que sur les hydrogels mous. Toutes les réponses induites par BayK(–) ont été supprimées avec la nisoldipine, confirmant que le LTCC a médié la réponse. Ces données indiquent que les altérations de la rigidité de l'ECM sont suffisantes pour modifier la communication structurale-fonctionnelle entre le LTCC et les mitochondries.

De manière significative, les altérations de l'activité métabolique et de Ψm observées dans les myocytes wt plaqués sur des hydrogels rigides ou mous imitaient les données précédentes obtenues à partir de cTnI-G203S par rapport aux myocytes cardiaques wt (Fig. 2d, h)6,17. Ces données indiquent qu'une rigidité accrue de la MEC peut contribuer à la progression de la physiopathologie de la CMH.

Nous avons examiné divers sites "linker" entre le LTCC et les mitochondries en tant que médiateurs potentiels de la fonction mitochondriale en réponse à une rigidité accrue du substrat. Nous avons constaté que les augmentations induites par BayK (-) de l'oxydation des flavoprotéines et de Ψm étaient significativement atténuées dans les myocytes wt plaqués sur des hydrogels mous et rigides en présence d'un peptide dérivé spécifiquement contre le LTCC AID cardiaque qui immobilise la sous-unité LTCC β2 (AID-TAT peptide, Fig. 1a) (Fig. 3a–f). Des résultats similaires ont été observés en présence d'un peptide qui cible le site d'interaction entre la sous-unité LTCC β2 et AHNAK (AHNAK-P4N-TAT, Fig. 1a) (Fig. 3a – f). De même, les altérations induites par BayK (-) à la fois dans l'oxydation des flavoprotéines et dans Ψm ont été abolies en présence d'agents de dépolymérisation de l'actine ou de la β-tubuline, la trunculine A ou la colchicine, respectivement (Fig. 3g – l). Ces données confirment un réseau structurel-fonctionnel clé entre le LTCC cardiaque et les mitochondries via le réseau cytosquelettique qui régule la fonction mitochondriale dans des conditions de rigidité altérée de la MEC.

Fluorescence représentative des flavoprotéines ratiométriques (a, b et g, h) et JC-1 (d, e et j, k) enregistrée à partir de myocytes cardiaques wt plaqués sur des hydrogels mous et rigides avant et après exposition à 10 μM BayK(+), ou 10 μM BayK(−) en l'absence ou en présence d'AID-TAT (10 μM), AHNAK-P4N-TAT (1 μM), Latrunculin A (Latrunc, 5 μM, 20 min pré-incubation) ou Colchicine (Colch, 1 μM, 3 h de pré-incubation51). Les études JC-1 ont été réalisées dans des conditions sans calcium (calcium 0 mM). Les flèches indiquent l'ajout de médicaments. Pour confirmer que les signaux étaient d'origine mitochondriale, du FCCP (50 μM) a été appliqué à la fin de chaque expérience de flavoprotéine pour augmenter l'oxydation des flavoprotéines. NaCN (40 mM) a été appliqué à la fin de chaque expérience JC-1 pour effondrer Ψm. Fluorescence globale des flavoprotéines (c et i) et JC-1 (f et l) pour tous les myocytes (n) exposés aux médicaments, comme indiqué, y compris la moyenne ± SEM. Toutes les significations statistiques sont déterminées par les tests de Kruskal-Wallis.

En plus d'un lien intracellulaire entre le LTCC et les mitochondries via le réseau cytosquelettique, une association structuralo-fonctionnelle semble également exister entre l'ECM et la F-actine via l'intégrine. Fait intéressant, nous constatons ici que les altérations induites par BayK (-) à la fois dans l'oxydation des flavoprotéines et dans Ψm étaient significativement atténuées dans les myocytes wt plaqués sur des hydrogels mous et rigides en présence d'un anticorps bloquant la fonction β1-intégrine murine (CD-29, Fig. 1a ) (Fig. 4a–f). Dans l'ensemble, ces données suggèrent que le LTCC cardiaque et l'intégrine peuvent participer en tant que partenaires dans la médiation de la fonction mitochondriale dans des conditions de rigidité ECM imitant le phénotype sain et HCM. Nous avons exploré plus avant ce réseau en manipulant la rigidité intracellulaire. Nous avons constaté que l'exposition de myocytes wt plaqués sur des hydrogels mous et rigides au jasplakinolide, un médicament qui stabilise la F-actine et rigidifie ainsi le réseau cytosquelettique34, était suffisante pour induire une augmentation significative de l'oxydation des flavoprotéines et de Ψm (Fig. 4g – l), indiquant un rôle potentiel de la rigidité du cytosquelette dans la régulation de la fonction mitochondriale dans les deux conditions. Ces résultats sont étayés par des études démontrant que les altérations des protéines du cytosquelette sont suffisantes pour influencer la fonction mitochondriale13,14,15.

Fluorescence représentative des flavoprotéines ratiométriques (a, b et g, h) et JC-1 (d, e et j, k) enregistrée à partir de myocytes cardiaques wt plaqués sur des hydrogels mous et rigides avant et après exposition à 10 μM BayK(+), Jasplakinolide (Jasp, 1 μM, 20 min de pré-incubation), ou 10 μM de BayK(-) en l'absence ou en présence de CD-29 (5 μg/ml, 30 min de pré-incubation). Les études JC-1 ont été réalisées dans des conditions sans calcium (calcium 0 mM). Les flèches indiquent l'ajout de médicaments. Pour confirmer que les signaux étaient d'origine mitochondriale, du FCCP (50 μM) a été appliqué à la fin de chaque expérience de flavoprotéine pour augmenter l'oxydation des flavoprotéines. NaCN (40 mM) a été appliqué à la fin de chaque expérience JC-1 pour effondrer Ψm. Fluorescence globale des flavoprotéines (c et i) et JC-1 (f et l) pour tous les myocytes (n) exposés aux médicaments, comme indiqué, y compris la moyenne ± SEM. Toutes les significations statistiques sont déterminées par les tests de Kruskal-Wallis.

Nous avons exploré la réversibilité de l'état mitochondrial hypermétabolique cTnI-G203S résultant de la mutation cTnI Gly203Ser, en testant l'effet de réduction de la rigidité du substrat sur Ψm et l'activité métabolique mitochondriale dans des myocytes cardiaques isolés de souris cTnI-G203S avec HCM établi. Les souris cTnI-G203S présentent des caractéristiques caractéristiques de la HCM, notamment l'hypertrophie et l'hypercontractilité à partir de 21 semaines d'âge5,6,17,35. Par conséquent, des myocytes cardiaques cTnI-G203S âgés de 30 à 50 semaines et des myocytes cardiaques wt appariés selon l'âge ont été étalés sur des hydrogels rigides et mous pendant au moins 3 h pour imiter respectivement la HCM innée et des conditions saines. Les altérations de la rigidité cellulaire et de la fonction mitochondriale ont ensuite été évaluées. Conformément aux données recueillies à partir de myocytes cardiaques wt âgés de 10 à 15 semaines, les myocytes wt âgés de 30 à 50 semaines plaqués sur des hydrogels rigides ont affiché une augmentation significative de la rigidité en compression par rapport aux hydrogels mous (p <0, 05, Fig. 5a). De plus, les myocytes cTnI-G203S âgés de 30 à 50 semaines plaqués sur des hydrogels mous ont affiché une diminution significative de la rigidité en compression par rapport à ceux plaqués sur des hydrogels rigides (p <0, 05, Fig. 5a). Ces données démontrent que la rigidité à la compression des myocytes cardiaques wt peut être manipulée pour imiter celle des myocytes cTnI-G203S, et vice versa. Conformément au phénotype HCM, des réponses exagérées ont été observées dans cTnI-G203S par rapport aux myocytes wt lorsqu'ils étaient étalés dans des conditions souples ou rigides (Fig. 5a). Bien qu'aucune altération de l'expression de la lamine A ou de la vinculine n'ait été observée, le placage de myocytes cTnI-G203S sur des hydrogels mous a entraîné une diminution significative de l'expression de l'intégrine β1 (Fig. 5b – g), impliquant l'intégrine en tant que protéine clé de mécanodétection dans les myocytes cTnI-G203S. .

a Rigidité à la compression (en kPa) des myocytes cardiaques isolés de souris cardiomyopathiques cTnI-G203S et homologues wt plaqués sur des hydrogels mous et rigides, y compris la moyenne ± SEM. b – g Images représentatives et points de données quantifiés pour les myocytes cardiaques cTnI-G203S plaqués sur des hydrogels rigides et mous colorés pour la lamine A (b, c), la vinculine (d, e) et l'intégrine (f, g), y compris la moyenne ± SEM . n = nombre de cellules, N = nombre de gels. Toutes les significations statistiques sont déterminées par les tests de Mann Whitney ou par le test de Kruskal-Wallis (a).

Nous avons également mesuré les altérations de l'activité métabolique mitochondriale et de Ψm dans les myocytes cardiaques isolés de souris cTnI-G203S âgées de 30 à 50 semaines étalées sur des hydrogels rigides et mous, en réponse à l'activation du LTCC à l'aide de BayK(-). Nous avons constaté que les myocytes cTnI-G203S étalés sur des hydrogels rigides et mous présentaient tous deux une augmentation significative de l'oxydation des flavoprotéines et de Ψm après exposition à BayK (-) par rapport à BayK (+) (Fig. 6a – f). L'ampleur de la réponse BayK(-) a été considérablement réduite sur les hydrogels souples par rapport aux hydrogels rigides, ce qui indique que la rigidité de l'ECM joue un rôle essentiel dans la régulation des altérations de la fonction mitochondriale dans la physiopathologie cTnI-G203S. Toutes les réponses induites par BayK (-) pourraient être atténuées par l'application de nisoldipine ou d'AID-TAT (Fig. 6a – f), confirmant qu'une communication structurelle-fonctionnelle entre le LTCC et les mitochondries médie la réponse. De plus, les altérations induites par BayK (-) dans l'oxydation des flavoprotéines et Ψm ont été significativement atténuées en présence de CD-29, alors que l'application de jasplakinolide seul était suffisante pour induire des augmentations significatives de l'oxydation des flavoprotéines et Ψm (Fig. 6g – l) . Pris ensemble, ces données suggèrent que le LTCC cardiaque et l'intégrine peuvent participer en tant que partenaires dans la médiation de l'état mitochondrial hypermétabolique présenté par les myocytes cTnI-G203S.

La flavoprotéine ratiométrique représentative (a, b et g, h) et la fluorescence JC-1 (d, e et j, k) ont enregistré des myocytes cardiaques isolés de souris cTnI-G203S cardiomyopathiques plaquées sur des hydrogels rigides et mous avant et après exposition à 10 μM BayK (+), Jasplakinolide (Jasp, 1 μM, 20 min de pré-incubation), ou 10 μM BayK(−) en l'absence ou en présence de nisoldipine (15 μM, Nisol), AID-TAT (10 μM) ou CD- 29 (5 μg/ml, 30 min de pré-incubation). Les études JC-1 ont été réalisées dans des conditions sans calcium (calcium 0 mM). Les flèches indiquent l'ajout de médicaments. Pour confirmer que les signaux étaient d'origine mitochondriale, du FCCP (50 μM) a été appliqué à la fin de chaque expérience de flavoprotéine pour augmenter l'oxydation des flavoprotéines. NaCN (40 mM) a été appliqué à la fin de chaque expérience JC-1 pour effondrer Ψm. Fluorescence globale des flavoprotéines (c et i) et JC-1 (f et l) pour tous les myocytes (n) exposés aux médicaments, comme indiqué, y compris la moyenne ± SEM. Toutes les significations statistiques sont déterminées par les tests de Kruskal-Wallis.

Pour étudier plus avant le rôle du LTCC et de l'intégrine β1 dans la progression de la maladie, nous avons évalué les niveaux d'expression de LTCC et de l'intégrine β1 dans l'homogénat de cœur entier prélevé sur des souris cTnI-G203S pré- et post-cardiomyopathiques. Nous n'avons trouvé aucune différence significative dans l'expression de LTCC dans les cœurs cTnI-G203S pré- et post-cardiomyopathiques ou dans les cœurs wt appariés selon l'âge (Fig. 7a, b et Fig. 2 supplémentaire). Cependant, des altérations de l'expression de l'intégrine β1 ont été observées dans les cœurs cTnI-G203S pré- et post-cardiomyopathiques par rapport à wt, les augmentations les plus importantes se produisant dans les cœurs post-cardiomyopathiques (Fig. 7c, d et Supplémentaire Fig. 2). Dans l'ensemble, les altérations de l'expression de l'intégrine semblent "s'aggraver" tard dans la progression de la maladie cTnI-G203S HCM. Cela peut être le signe d'un état inadapté36.

Analyse par immunoblot de l'expression de la protéine du canal calcique de type L (a, b) et de l'intégrine β1 (c, d) réalisée sur un homogénat cardiaque total regroupé à partir de groupes de 5 patients pré- (10-15 semaines) ou post-cardiomyopathiques (30 -50 semaines) souris cTnI-G203S et homologues wt du même âge. Immunoblots représentatifs sondés avec l'anticorps de la sous-unité α1C du canal calcique de type L (CaV1.2, a) ou de l'intégrine β1 (c), puis l'anticorps monoclonal GAPDH. Analyse densitométrie de l'expression de la protéine CaV1.2 (b) ou de l'intégrine β1 (d), normalisée à l'expression GAPDH associée. n = nombre de répétitions techniques. Une ANOVA de Browne-Forsythe et Welch (b) ou un test de Kruskal-Wallis (d) a déterminé la signification statistique. Analyse densitométrie de l'expression relative de mTOR (calculée en tant que Phospho-mTOR/Total mTOR) réalisée sur des fractions cytoplasmiques (e) et nucléaires (f) regroupées à partir de groupes de cinq souris cTnI-G203S pré- ou post-cardiomyopathiques et homologues wt du même âge. Les anticorps β-tubuline et histone H2B ont été utilisés comme contrôles de charge pour les fractions cytoplasmiques et nucléaires respectivement. n = nombre de répétitions techniques. Une ANOVA de Browne-Forsythe et Welch (e) ou un test de Kruskal-Wallis (f) a déterminé la signification statistique. g Schéma indiquant le lien structurel-fonctionnel entre le canal calcique de type L, le réseau cytosquelettique, les mitochondries, l'intégrine et la matrice extracellulaire dans les myocytes cardiaques wt et cTnI-G203S. Une architecture cytosquelettique perturbée dans les myocytes cardiaques cTnI-G203S peut déclencher un mécanisme de rétroaction inadapté entre l'augmentation de la rigidité de la matrice cytosquelettique et extracellulaire, entraînant un état mitochondrial hypermétabolique.

La cible mammifère de la rapamycine (mTOR) est une voie de signalisation indépendante du calcium, qui est un régulateur clé de la synthèse des protéines, de la biogenèse mitochondriale et du métabolisme cellulaire, et a été impliquée dans le développement de HCM37,38,39. Les myocytes isolés de souris cTnI-G203S présentent une augmentation de la taille et de la densité des mitochondries par rapport aux myocytes wt, mais aucune altération de la concentration de calcium intracellulaire2,3. Par conséquent, ici, nous avons testé l'implication de mTOR dans le développement de la cardiomyopathie cTnI-G203S. Des altérations de l'activité métabolique mitochondriale médiée par le LTCC et un état mitochondrial hypermétabolique résultant se produisent avant le développement de la pathologie cTnI-G203S6,17. Pour déterminer si des altérations de l'expression des protéines se produisent tôt ou tard dans la progression de la maladie, nous avons évalué l'expression de mTOR dans des fractions cytoplasmiques et nucléaires préparées à partir de cœurs de souris cTnI-G203S pré- et post-cardiomyopathiques. L'expression de mTOR phosphorylé (phospho-mTOR) a été normalisée par rapport au mTOR total pour donner une expression "relative" de mTOR (veuillez vous reporter aux figures supplémentaires 3 et 4 pour les données individuelles de phospho-mTOR et de mTOR total). Nous avons constaté que l'expression relative de mTOR était significativement augmentée dans les fractions cTnI-G203S post-cardiopathiques et wt cytoplasmiques (Fig. 7e) et nucléaires (Fig. 7f); soutenant la notion que mTOR peut jouer un rôle dans le processus de vieillissement cardiaque « normal »37. Cependant, l'expression relative de mTOR était significativement élevée dans les fractions nucléaires cTnI-G203S pré- et post-cardiomyopathiques par rapport aux homologues wt du même âge (Fig. 7f). Ces données suggèrent que l'activation de mTOR peut également contribuer à la phase précoce de la maladie. Cependant, d'autres études fonctionnelles utilisant les plateformes décrites dans cette étude seraient nécessaires pour confirmer un rôle causal de mTOR dans la progression de la maladie.

Une « rupture de communication » intracellulaire entre le LTCC et les mitochondries contribue à un état mitochondrial hypermétabolique résultant de mutations des gènes de la chaîne lourde cTnI et β-myosine6,17,31. Ces réponses précèdent le développement de HCM. L'augmentation de la synthèse des protéines ECM a été impliquée dans la progression de la pathologie HCM humaine20,21,22. Ici, en utilisant une plate-forme in vitro qui imite la rigidité myocardique HCM, nous démontrons que les altérations de la rigidité du substrat peuvent moduler la communication structurelle-fonctionnelle entre le LTCC et les mitochondries. Cela semble se produire via des sites "lieurs" clés au sein du réseau cytosquelettique, dans des conditions à la fois saines et HCM (Figs. 2 et 6). Avec cela, nous proposons qu'une rigidité accrue de la MEC, en amont du LTCC, puisse contribuer à la progression de la physiopathologie de la HCM résultant de la mutation du gène Gly203Ser. À l'appui de cela, des tissus cardiaques modifiés créés en ensemençant des myocytes cardiaques dérivés de cellules souches pluripotentes humaines en bonne santé sur des bandes de myocarde décellularisé récoltées à partir d'un modèle porcin de HCM présentent une rigidité accrue21.

Nous constatons que l'inhibition de l'intégrine β1 de la protéine mécanodétectrice a aboli les altérations induites par le LTCC dans l'activité métabolique mitochondriale, tandis que l'augmentation de la rigidité cytosquelettique a simulé les altérations induites par le LTCC dans la fonction mitochondriale (Figs. 4 et 6). Fait intéressant, le LTCC cardiaque et l'intégrine β1 sont des protéines transmembranaires qui s'associent structurellement et fonctionnellement à la F-actine12,23,25,26. Il existe de bonnes preuves que la mécanotransduction cardiaque se produit à la fois de l'intérieur vers l'extérieur et de l'extérieur vers l'intérieur40,41. Avec cela, nous proposons un mécanisme de rétroaction entre l'ECM et le réseau cytosquelettique, via l'intégrine, qui aide à réguler les altérations de la fonction mitochondriale médiée par le LTCC dans des conditions saines, mais devient inadapté en réponse à la mutation du gène sarcomère Gly203Ser, participant ainsi à la progression de la État de la maladie HCM (Fig. 7g). Pour évaluer l'effet des modifications de la rigidité du substrat sur la régulation de la fonction mitochondriale par le LTCC dans des conditions saines et HCM, toutes les études de cet article ont été réalisées dans des myocytes cardiaques au repos. De plus, pour explorer le rôle régulateur métabolique du lien structurel-fonctionnel entre le LTCC et les mitochondries, des altérations de Ψm ont été réalisées dans des conditions sans calcium. Des études futures impliquant des mesures de la contractilité seraient nécessaires pour élucider davantage le rôle de la rigidité de la MEC sur les mécanismes identifiés dans cette étude.

Des études génétiques ont identifié plus de 1500 mutations différentes du gène du sarcomère associées au développement de HCM4. Un examen des études portant sur la physiopathologie de la HCM a révélé que, bien que certaines similitudes existent, chaque mutation semble conduire à une physiopathologie spécifique à la mutation42. Par conséquent, une enquête plus approfondie serait nécessaire pour confirmer l'implication du mécanisme proposé dans le développement de HCM spécifiques provoquant des mutations du gène sarcomérique. D'un point de vue thérapeutique, le traitement des souris cTnI-G203S avec AID-TAT restaure la cinétique LTCC, l'activité métabolique mitochondriale et prévient le développement de l'hypertrophie17. D'autres études impliquant l'analyse protéomique du tissu cardiaque de patients HCM présentant des mutations identifiées du gène sarcomérique suggèrent que le réseau de microtubules est une cible de traitement potentielle43. Ces résultats soutiennent l'idée que le ciblage des réponses cellulaires en aval à la rigidité de la MEC peut être une considération importante dans le développement de thérapies préventives44. Avec une caractérisation plus poussée, les sites clés de «liaison» entre le LTCC et les mitochondries et / ou la modification des protéines sarcomères peuvent représenter des cibles thérapeutiques potentielles pour le développement d'approches de traitement HCM pour les patients présentant des mutations du gène sarcomère identifiées.

Des hydrogels de polyacrylamide (PA) ont été fabriqués sur la base d'une méthode décrite précédemment45. Des solutions de prépolymères pour hydrogels imitant un myocarde sain (doux) et HCM (raide) ont été fabriquées en combinant de l'acrylamide (Bio-Rad), du bis-acrylamide (Bio-Rad), du PBS de Dulbecco (sans Mg2+ et Ca2+) (Life Technologies) et H2O déionisée (voir le tableau 1 pour la recette). Les lamelles ont été nettoyées et activées dans un nettoyeur à l'ozone pendant 1 min de chaque côté (Bioforce Nanosciences UV/Ozone ProCleaner), puis fonctionnalisées pendant 5 min dans une solution contenant du méthacrylate de 3-(triméthoxysilyl)propyle (0,5 % V/V) (Merck) , acide acétique glacial (3 % V/V) et éthanol pur (96,5 % V/V). Les lamelles fonctionnalisées ont été rincées à l'éthanol pendant 1 min et laissées sécher à l'air, puis recouvertes de diméthydichlorosilane (DCDMS) pour créer une surface plane et non adhésive pour fabriquer des hydrogels. Une solution de polymère a ensuite été préparée en ajoutant 10 µl de persulfate d'ammonium (APS) (Bio-Rad) et 1 µl de N,N,N′,N′-tétraméthyléthylènediamine (TEMED) (Bio-Rad) à 1 ml de pré- solution polymère. Ensuite, 4 ou 12 µl de solution de polymère ont été pipetés sur des lames de verre recouvertes de DCDMS pour atteindre une hauteur finale de 50 µm (pour des lamelles rondes de 10 mm de diamètre ou des lamelles carrées de 15 × 15 mm2 respectivement). Des lamelles fonctionnalisées ont ensuite été délicatement placées sur le dessus. Les hydrogels ont été autorisés à polymériser pendant 20 minutes avant que les lamelles couvre-objets ne soient retirées des lames recouvertes de DCDMS et stérilisées aux UV.

Les hydrogels ont été rincés trois fois dans du tampon acide 4-(2-hydroxyéthyl)-1-pipérazineéthanesulfonique (HEPES) (50 mM, pH 8,5) (Life Technologies), puis immergés dans du N-sulfosuccinimidyl-6-(4′- azido-2 ′-nitrophénylamino) hexanoate (sulfo-SANPAH ; Thermo Scientific) dans HEPES (1 mg/ml). Sulfo-SANPAH a été activé sous lumière UV (365 nm, 10 min), puis retiré et les hydrogels rincés dans HEPES. Les hydrogels ont ensuite été immergés dans de la laminine de souris (ThermoFisher 23017015) dans de l'HEPES (25 µg/ml) et incubés pendant une nuit à 37 °C. Avant utilisation, les hydrogels ont été rincés avec du PBS pour éliminer la laminine non liée.

La microscopie à force atomique (AFM) a été utilisée pour mesurer la rigidité en compression des hydrogels et des cellules individuelles, mesurée en modules de Young. Les mesures ont été effectuées avec un microscope à force atomique MFP-3D (Asylum Research), en utilisant des porte-à-faux en nitrure de pyrex revêtus de chrome/or de 200 µm avec des pointes de forme triangulaire (modèle Nano World PNP-TR). Les mesures ont été effectuées dans du PBS 1X (sans Mg2+ ni Ca2+) et sondées avec des indentations de 2nN (vitesse d'approche : 2 µm/s, vitesse de rétraction : 10 µm/s). La partie linéaire de la courbe de force générée par le contact a été utilisée pour déterminer le module de Young grâce à un code écrit sur mesure dans Igor Pro, comme décrit précédemment46. Les indentations ont été faites en triple pour assurer la stabilité des mesures et moyennées pour donner une rigidité moyenne par indentation. Six points à travers chaque hydrogel ont été choisis au hasard pour être en retrait. La moyenne de ces six indentations a été utilisée comme estimation de la rigidité globale à la compression de l'hydrogel47. Deux répétitions techniques par répétition biologique ont été caractérisées pour s'assurer que les hydrogels étaient d'une rigidité constante. La rigidité des cellules a été caractérisée par une indentation au centre des cellules individuelles. Environ 28 cellules ont été indentées par répétition biologique27,48. Pour la rigidité des cellules individuelles, quatre répétitions techniques ont été effectuées par répétition biologique. Un minimum de quatre répétitions biologiques ont été effectuées par condition.

La lignée cellulaire de myoblastes H9C2, isolée à partir de tissu ventriculaire de rat, a été fournie par la Collection européenne de cultures cellulaires (ECACC, Salisbury, Royaume-Uni) et achetée auprès de CellBank Australia (Westmead, NSW, numéro de catalogue 88092904). Les cellules H9C2 ont été cultivées conformément aux instructions de l'ECACC. Les cellules ont été réanimées dans un milieu de croissance complet composé de milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM, glucose élevé, pyruvate, ThermoFisher), additionné de glutamine 4 mM et de sérum de veau fœtal à 10 %. Les cellules ont été ensemencées à 1–3 × 10 000 cellules/cm2. Les changements de média ont été effectués une fois tous les 2 à 3 jours. La sous-culture a été réalisée à ~ 70–80% de confluence. Pour sous-culturer ou plaquer sur des hydrogels PA, le DMEM a été retiré et jeté, remplacé par 0,25 % de trypsine-EDTA (ThermoFisher) et incubé pendant environ 3 min (37 °C) avant de centrifuger la suspension cellulaire à 1200 tr/min (5 min). Le surnageant a ensuite été retiré et le culot remis en suspension dans un milieu de croissance complet préchauffé. Pour les hydrogels PA, les cellules ont été étalées à 10 000 cellules par hydrogel (souple ou rigide) et incubées pendant 24 à 48 h à 37 ° C avant l'expérimentation.

Des souris mâles ont été utilisées pour toutes les études. Des myocytes cardiaques adultes isolés de souris exprimant le gène cTnI humain codant pour la HCM humaine provoquant la mutation cTnI-G203S ont été utilisés. Les souris développent des caractéristiques caractéristiques de HCM à 21 semaines5,6,17,35. Des souris cTnI-G203S âgées de 10 à 15 semaines (pré-cardiomyopathiques) et de 30 à 50 semaines (post-cardiomyopathiques) ont été utilisées pour des études in vitro et ex vivo. Des souris appariées selon l'âge exprimant le gène cTnI humain normal ont été utilisées comme témoins (wt). Des souris mâles ont été utilisées pour éliminer les différences potentielles dans les réponses dues au sexe. Des expériences ont été réalisées sur un total de soixante-quatorze souris wt âgées de 10 à 15 semaines, dix souris cTnI-G203S âgées de 10 à 15 semaines, seize souris wt âgées de 30 à 50 semaines et quarante-cinq souris âgées de 30 à 30 semaines. Souris cTnI-G203S âgées de 50 semaines. Tous les animaux ont été assignés au hasard à des groupes de traitement. Toutes les études animales ont été approuvées par le Comité d'éthique animale de l'Université d'Australie-Occidentale conformément au Code de pratique australien pour le soin et l'utilisation des animaux à des fins scientifiques (NHMRC, 8e édition, 2013).

Des myocytes cardiaques adultes ont été isolés de souris wt et cTnI-G203S comme décrit précédemment16,17,49. Les souris ont été anesthésiées avec du pentobarbital sodique (240 mg/kg, par injection intrapéritonéale) puis les cœurs ont été excisés et canulés sur un appareil de Langendorff via l'aorte. Les cœurs ont été perfusés avec du tampon de Krebs–Henseleit (KHB) contenant (en mM) : 120 NaCl, 25 NaHCO3, 4,8 KCl, 2,2 MgSO4, 1,2 NaH2PO4 et 11 glucose (pH = 7,35 avec O2/CO2 à 37 °C) pendant : 4 min à 37 °C, puis 3 min en présence de 2,4 mg/ml de collagénase B, puis 8 min en présence de 40 µM de calcium. Après la perfusion, le tissu ventriculaire a été détaché et trituré pour dissocier les myocytes en suspension. La suspension de myocytes a été laissée à se déposer pendant 20 min, le surnageant a été jeté et les myocytes ont été remis en suspension dans une solution tamponnée à l'hépès (HBS) sans calcium contenant (en mM) : 5,3 KCl, 0,4 MgSO4·7H2O, 139 NaCl, 5,6 Na2HPO4·2H2O, 5 glucose , 20 Hepes et 2 glutamine (pH = 7,4 à 37 ° C) en présence ou en l'absence d'EGTA 3 mM (pour des expériences de calcium 0 mM). Pour les expériences contenant du calcium, le calcium a été dosé pour atteindre une concentration extracellulaire finale de 1,8 mM. Les suspensions de myocytes ont été étalées sur des hydrogels et incubées pendant au moins 3 h à 37 ° C avant l'expérimentation. Toutes les études in vitro ont été réalisées sur des myocytes au repos fraîchement isolés à 37 °C.

Les cellules ont été préparées pour l'imagerie confocale sur la base des méthodes décrites précédemment7,16. Après étalement et incubation, les cellules H9C2 ou les myocytes cardiaques adultes ont été lavés trois fois avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS), contenant en mM : 13 KCl, 7,35 KH2PO4, 0,69 NaCl, 40,4 et 40,4 Na2HPO4·7H2O (pH = 7,4), puis fixés avec 4 % de paraformaldéhyde (PFA, dans du PBS, pendant 15 min) et perméabilisé avec 0,3 % de Triton X-100 (15 min). Après perméabilisation, les cellules ont été incubées dans une solution de blocage contenant 5 % de sérum de chèvre et 5 % de sérum de cheval (dans du PBS) pendant 1 h à 37 °C. Les cellules ont ensuite été incubées avec des anticorps primaires lamine A (1: 400, Abcam, ab26300) et vinculine (1: 200, Abcam, ab130007) dans 5% de BSA (dans du PBS, 1 h à 37 ° C). Les cellules ont ensuite été incubées avec de la rhodamine phalloïdine (TRITC, 1:400, ThermoFisher, R415), du Goat F(ab) Anti-Rabbit IgG H&L (FITC, 1:200, Abcam ab7050) et du Goat Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor® 647, 1:200, Abcam ab150115) dans du BSA à 5 % (dans du PBS, 1 h à 37 °C). Alternativement, les cellules ont été incubées avec un anticorps primaire d'intégrine β1 (1: 100, ThermoFisher MA1-06906) dans 5% de BSA (dans du PBS, 1 h à 37 ° C), suivi de Goat anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor® Plus 488, 1:400, ThermoFisher A32723) dans 5 % de BSA (dans du PBS, 1 h à 37 °C). Enfin, les cellules ont été incubées avec une coloration d'acide nucléique DAPI (1: 200 dans du PBS, Sigma-Aldrich D9542) pendant 10 min à température ambiante avant d'être montées sur des lames de verre pour l'imagerie. Les cellules ont été imagées sur un microscope à fluorescence inversé Olympus IX71 à un grossissement de 60 ×.

L'iodure de 5,5',6,6'-tétrachloro-1,1',3,3'-tétraéthylbenzimidazolylcarbocyanine (JC-1) a été acheté auprès de Molecular Probes (Eugene, Oregon, USA). Le cyanure de carbonyle-4-(trifluorométhoxy)phénylhydrazone (FCCP), la colchicine, la latrunculine A, la nisoldipine, le (S)-(−)-Bay K8644 (BayK(−)) et le cyanure de sodium (NaCN) ont été achetés chez Merck (Kenilworth, New Jersey, États-Unis). Le jasplakinolide a été acheté auprès de Cayman Chemical (Ann Arbor, Michigan, États-Unis); (R)-(+)-Bay K8644 (BayK(+)) de BioVision (Milpitas, Californie, USA); et CD-29 de BD Biosciences (Franklin Lakes, New Jersey, États-Unis). Le peptide AID-TAT a été synthétisé à l'aide de la séquence d'acides aminés QQLEEDLKGYLDWITQAE comprenant une séquence TAT pénétrant dans les cellules (RKKRRQRRR) attachée via l'acide 6-aminohexanoïque (AusPep, Tullamarine, Victoria, AUS)50. Le peptide AHNAK-P4N-TAT a été synthétisé en utilisant la séquence d'acides aminés KGKHGKLKFGTFGGLGSKSKGHYEVT attachée à la séquence TAT comme décrit précédemment (Mimotopes Pty Ltd, Victoria, AUS).

Le potentiel de membrane mitochondriale (Ψm) a été évalué à l'aide de l'indicateur fluorescent JC-1 (200 nM, période d'incubation = 3 h, ex = 480 nm, em = 580/535 nm, intervalle = 2 min, exposition = 50 ms)16,17. À la fin de chaque expérience, du cyanure de sodium bloquant le transport d'électrons mitochondrial a été appliqué pour effondrer Ψm, confirmant que le signal JC-1 était indicatif de Ψm (NaCN, 40 mM). L'oxydation des flavoprotéines mitochondriales a été évaluée en enregistrant l'autofluorescence des myocytes comme décrit précédemment (ex = 480 nm, em = 535 nm, intervalle = 1 min, exposition = 250 ms)16,17. Le découpleur de chaîne de transport d'électrons mitochondrial FCCP (50 μM) a été ajouté à la fin de chaque expérience pour augmenter l'oxydation des flavoprotéines, confirmant que le signal était d'origine mitochondriale. Toute la fluorescence in vitro a été mesurée sur une caméra Andor Zyla SCMOS 5,5 MP fixée à un microscope inversé Nikon TE2000-U. Les images fluorescentes ratiométriques de JC-1 ou de flavoprotéine ont été quantifiées à l'aide de Metamorph 7.10. Les régions contenant des myocytes ont été tracées manuellement pour obtenir un signal fluorescent pour chaque cellule. Une région équivalente ne contenant pas de cellules a été utilisée comme arrière-plan et soustraite pour chaque cellule. Les réponses aux traitements ont été rapportées sous la forme d'un pourcentage d'augmentation ou de diminution par rapport à la moyenne (de base) avant le traitement.

La concentration en protéines de tous les échantillons a été quantifiée à l'aide du dosage des protéines de Bradford en utilisant la BSA comme étalon. Des échantillons de 25 µg ont été chargés dans un gel de polyacrylamide SDS Mini-PROTEAN® TGX Stain-FreeTM 10% BIO-RAD prémoulé (Bio-RAD Laboratories), puis transférés par électrophorèse sur une membrane de nitrocellulose de 0,2 µm (Trans-Blot® TurboTM Transfer Pack, Bio- RAD Laboratories) à l'aide du système de transfert Bio-RAD Trans-Blot® TurboTM. Les transferts ont été éliminés entre chaque étape de nouveau sondage à l'aide d'un tampon d'élimination, constitué de (en mM) : Tris HCl pH 6,8 : 62,5, 2-mercaptoéthanol : 100, 2 % SDS, 30 min à 50 °C). Une densitométrie quantitative a été réalisée sur des images capturées à l'aide d'un système d'imagerie Chemidoc (Bio-rad) et du logiciel ImageJ. Les données sont présentées sous forme de densité optique de l'expression protéique, normalisée au contrôle de chargement détecté sur le même blot.

Une analyse par immunotransfert a été réalisée sur un homogénat cardiaque total regroupé à partir de groupes de cinq souris wt et cTnI-G203S âgées de 10 à 15 semaines et de 30 à 50 semaines. En bref, des cœurs surgelés ont été pesés, broyés en une poudre fine dans du N2 liquide à l'aide d'un mortier et d'un pilon, et homogénéisés dans un tampon RIPA 1:4 composé de (en mM) : NaCl 150, Tris 50, Na4P2O7 20, Na3VO4 2, NaF 1, désoxycholate de Na à 0,5 %, Triton X-100 à 1 %, SDS à 0,1 %, pH 7,4, additionné de cOmplete™, Mini, protéase sans EDTA (Roche, 4693159001) et PhosStop™ phosphatase (Roche, 4906837001, dilution 1:100 ) comprimés inhibiteurs. L'homogénat de cœur total a ensuite été centrifugé à 10 000 g pendant 5 min à 4 °C. Les transferts ont été sondés avec les anticorps primaires suivants : anti-CaV1.2 polyclonal de lapin (Alomone, ACC-003, 1:200) ou intégrine anti-β1 monoclonale de lapin (D6S1W) (Cell Signaling Technology 34971, 1:1000). Un anti-GAPDH monoclonal de lapin (Cell Signaling Technology, 2118, 1:1000) a été utilisé comme témoin de charge. Les transferts ont ensuite été sondés avec un anticorps secondaire pré-absorbé polyclonal de chèvre anti-lapin IgG H&L (HRP) (Abcam, ab97080, 1:10 000).

Des fractions subcellulaires ont été préparées à partir de groupes de cinq cœurs wt et cTnI-G203S âgés de 10 à 15 semaines et de 30 à 50 semaines, un kit d'extraction nucléaire et cytoplasmique NE-PERTM (ThermoFisher Scientific, 78833), complété par cOmplete™ , Mini, comprimés inhibiteurs de protéase sans EDTA (Roche, 4693159001) et PhosStopTM phosphatase (Roche, 4906837001), selon les protocoles du fabricant. Les transferts ont été sondés avec les anticorps primaires suivants : mTOR total, mAb de lapin mTOR (7C10) (Cell Signaling Technology, 2983, 1:1000) ; mTOR actif, phospho-mTOR (Ser2448) (D9C2) XP® Rabbit mAb (Cell Signaling Technology, 5536, 1:1000); mAb de lapin total SRP6, protéine ribosomique S6 (5G10) (Cell Signaling Technology, 2217, 1:1000); AcM de lapin SRP6 actif, protéine ribosomique phospho-S6 (Ser235/236) (2F9) (Cell Signaling Technology, 4856, 1:1000). Les anticorps primaires suivants ont été utilisés pour charger les contrôles : anticorps β-tubuline (Cell Signaling Technology, 2146, 1:500) ; AcM de lapin histone H2B (D2H6) (Cell Signaling Technology, 12364, 1:1000). Les transferts ont été sondés avec un anticorps secondaire préadsorbé anti-lapin IgG H&L (HRP) de chèvre (Abcam, ab97080, 1:10000). Les mêmes anticorps ont été utilisés pour confirmer la pureté des fractions cytoplasmiques et nucléaires (Fig. 5 supplémentaire).

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Les résultats sont rapportés sous forme de moyenne ± SEM. Pour les données non paramétriques, la signification statistique a été acceptée à P < 0,05 en utilisant le test de Mann Whitney (bilatéral) ou le test de Kruskal-Wallis (unidirectionnel) pour les comparaisons multiples. Pour les données paramétriques, la signification statistique a été acceptée à P <0, 05 à l'aide d'un test ANOVA de Brown-Forsythe et Welch (unidirectionnel) (GraphPad Prism version 9.1.2). Le nombre de répétitions et les comparaisons statistiques sont indiqués en chiffres.

Le logiciel Power and Sample Size (PS) a été utilisé pour déterminer la taille de l'échantillon en tenant compte de la variabilité inter-animal et de la variabilité intra-animal. Avec cela, il a été déterminé que les réponses devraient être étudiées chez 10 souris de chaque souche/génotype de souris afin de rejeter l'hypothèse nulle selon laquelle les moyennes de population des groupes expérimentaux sont égales avec une probabilité/puissance de 0,95 (probabilité d'erreur de type I = 0,05). Il convient de noter que les valeurs de p résultant de toutes les données in vitro variaient de p < 0,0001 à p < 0,0216, indiquant que les tailles d'échantillon utilisées étaient suffisantes pour dépasser le niveau de signification défini.

Aucune donnée obtenue à partir de cellules vivantes n'a été exclue. Toutes les tentatives de réplication dans des cellules vivantes ont été couronnées de succès. Pour les études in vitro, des expériences impliquant l'utilisation de différents agonistes/antagonistes ont été réalisées sur différents jours expérimentaux, de manière aléatoire. De plus, deux personnes ont mené des expériences simultanément, sur deux configurations expérimentales fluorescentes différentes. Une personne était au courant des agonistes/antagonistes appliqués pour s'assurer que les bons agents étaient appliqués dans le bon ordre. L'autre individu était aveugle. Les données ont été reproduites de manière fiable entre les individus dans tous les cas.

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports sur le portefeuille Nature lié à cet article.

Toutes les données générées ou analysées au cours de cette étude sont incluses dans cet article publié (et le fichier d'informations supplémentaires). Les données sources peuvent être obtenues dans le fichier de données supplémentaires.

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Nous reconnaissons avec gratitude l'assistance technique de Mme Sarah Wong dans l'acquisition et le traitement des données d'immunoblot mTOR. Subvention de projet APP1143203 (HMV) du Conseil national de la santé et de la recherche médicale d'Australie. Subvention de projet APP1098449 (YSC) du Conseil national de la santé et de la recherche médicale d'Australie. Conseil national de la santé et de la recherche médicale d'Australie Bourse de recherche principale APP1117366 (LCH). Heart Foundation of Australia Future Leader Fellowship 101930 (HMV). Heart Foundation Australia Future Leader Fellowship 101173 (YSC). Bourse du programme de formation à la recherche du gouvernement australien (ILC). Bourse de recherche APP1173015 (DS) du Conseil national de la santé et de la recherche médicale d'Australie.

École des sciences humaines, Université d'Australie occidentale, Crawley, WA, Australie

Helena M. Viola, Caitlyn Richworth, Tanya Solomon, Ian L. Chin, Henrietta Cserne Szappanos, Yu Suk Choi et Livia C. Hool

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Srinivasan Sundararaj, Dmitry Shishmarev et Marco G. Casarotto

Institut de recherche cardiaque Victor Chang, Sydney, NSW, Australie

Livia C.Hool

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Conceptualisation : HMV, LH Conservation des données : HMV, CR, TS, ILC, HCS, SS, DS Analyse formelle : HMV, ILC, YSC, HCS, SS, DS Enquête : HMV, CR, TS, ILC, HCS, SS, DS Méthodologie : HMV, YSC Administration du projet : HMV Supervision : HMV, YSC, HCS, MC, LH Validation : HMV, YSC, MC Visualisation : HMV Rédaction—Préparation du projet original : HMV Rédaction—Révision et édition : HMV, CR, TS, ILC , YSC, HCS, SS, DS, MC, LH

Correspondance à Helena M. Viola ou Livia C. Hool.

MC, SS, DS et LH sont des inventeurs titulaires d'un brevet déposé (numéro de demande australien 2021900252). Tous les autres auteurs déclarent n'avoir aucun intérêt concurrent.

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Viola, HM, Richworth, C., Solomon, T. et al. Un mécanisme de rétroaction inadapté entre la matrice extracellulaire et le cytosquelette contribue à la physiopathologie de la cardiomyopathie hypertrophique. Commun Biol 6, 4 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-022-04278-9

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Reçu : 22 février 2022

Accepté : 17 novembre 2022

Publié: 03 janvier 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s42003-022-04278-9

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