Un pic de cytokines circulantes TNF | Maladies infectieuses du Guizhou Inc.

Rapports scientifiques volume 13, Numéro d'article : 9119 (2023) Citer cet article

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Le transport moléculaire entre les systèmes circulatoire et musculo-squelettique régule la physiologie des articulations articulaires dans la santé et la maladie. L'arthrose (OA) est une maladie articulaire dégénérative liée à une inflammation systémique et locale. Les événements inflammatoires impliquent des cytokines, qui sont sécrétées par les cellules du système immunitaire et modulent le transport moléculaire à travers les interfaces tissulaires (appelées fonction de barrière des jonctions serrées [TJ]). Dans une étude précédente de notre groupe, il a été démontré que les tissus de l'articulation du genou arthrosique présentaient une séparation de taille de molécules de différentes tailles délivrées en un seul bolus au cœur (Ngo et al. dans Sci. Rep. 8:10254, 2018). Ici, dans une étude de suivi de conception parallèle, nous testons l'hypothèse selon laquelle deux cytokines communes, avec des rôles multiples dans l'étiologie de l'arthrose ainsi que dans l'état immunitaire en général, modulent les propriétés de la fonction barrière des interfaces tissulaires articulaires. Plus précisément, nous sondons l'effet d'une augmentation aiguë des cytokines (pic) sur le transport moléculaire dans les tissus et à travers les interfaces tissulaires des systèmes circulatoire et musculo-squelettique. Un bolus unique de dextrane de 70 kDa marqué par fluorescence a été administré par voie intracardiaque, soit seul, soit avec la cytokine pro-inflammatoire TNF-α ou la cytokine anti-inflammatoire TGF-β, jusqu'à la maturation squelettique (enfants âgés de 11 à 13 mois). ) cobayes (Dunkin-Hartley, un modèle animal d'arthrose spontanée). Après cinq minutes de circulation, les articulations du genou entières ont été sectionnées en série et la face du bloc fluorescent cryo-imagée à une résolution proche de la cellule unique. Le traceur marqué par fluorescence de 70 kDa est de taille analogue à l'albumine, la protéine de transport sanguin la plus répandue, et la quantification de l'intensité de fluorescence du traceur a donné une mesure de la concentration du traceur. En cinq minutes, un pic (doublement aigu) des cytokines circulantes TNF-α ou TGF-β a considérablement perturbé la fonction de barrière entre les systèmes circulatoire et musculo-squelettique, la fonction de barrière étant essentiellement abrogée dans le groupe TNF-α. Dans tout le volume de l'articulation (y compris tous les compartiments tissulaires et la musculature de liaison), la concentration de traceurs a été significativement réduite dans le TGF-β- et le TNF-α- par rapport au groupe témoin. Ces études impliquent des cytokines inflammatoires en tant que gardiens du passage moléculaire dans et entre les compartiments tissulaires de nos articulations et peuvent ouvrir de nouveaux moyens pour retarder l'apparition et atténuer la progression des maladies articulaires dégénératives telles que l'arthrose, en utilisant des mesures pharmaceutiques et/ou physiques.

Les tissus articulaires, y compris le cartilage, la synoviale, l'os, l'os sous-chondral, la musculature périarticulaire, le ménisque, le ligament et d'autres tissus conjonctifs, forment un biosystème intégré. Les cellules musculo-squelettiques dépendent pour leur survie du mouvement des molécules, du système cardiovasculaire vers et entre les compartiments tissulaires vascularisés et avasculaires au sein de l'articulation1,2,3. Une étude récente de notre groupe a montré que les compartiments des tissus musculo-squelettiques présentent une sélectivité de taille moléculaire, suggérant la présence de propriétés de barrière fonctionnelle aux interfaces tissulaires telles que le périoste et la membrane synoviale, et impliquant des modifications du transport moléculaire liées à l'âge dans la pathogenèse de l'arthrose4. L'albumine (67 kDa), la principale protéine porteuse du plasma sanguin, présente une limite supérieure pour la perméabilité de la taille moléculaire dans le tissu osseux en l'absence de charge mécanique5. On ignore actuellement dans quelle mesure l'albumine et les protéines plus grosses imprègnent les compartiments tissulaires du complexe articulaire synovial.

Bien que les mécanismes sous-jacents de l'arthrose soient mal compris, il existe de plus en plus de preuves que des changements dans le transport moléculaire à l'intérieur et entre les compartiments tissulaires, provoqués par une inflammation systémique, peuvent sous-tendre ou au moins prédisposer les patients à l'arthrose6,7,8. L'arthrose a longtemps été considérée comme une maladie du cartilage uniquement. Les paradigmes actuels considèrent désormais l'arthrose comme une condition de l'ensemble de l'articulation, la rupture de la communication cellulaire entre les tissus de l'articulation étant au cœur de la pathogenèse et de la progression de l'arthrose9. À ce jour, peu d'études ont abordé le rôle de l'interface tissulaire en tant que gardien du transport moléculaire entre les systèmes cardiovasculaire et musculo-squelettique. Une approche multi-échelle, c'est-à-dire de sous-cellule à tissu à organe, peut être particulièrement utile pour comprendre l'interaction de l'inflammation systémique chronique typique de l'arthrose, des pics inflammatoires aigus de cytokines associés à un traumatisme ou à une exposition à des bactéries/virus, et au transport moléculaire dans et entre les compartiments tissulaires de l'arthrose. Le joint. Cela représente une lacune importante mais négligée dans les connaissances dans le domaine et peut jouer un rôle important dans la compréhension des pathogenèses de l'arthrose ainsi que d'autres maladies articulaires dégénératives.

L'inflammation systémique chronique de bas grade est caractérisée par des niveaux soutenus et accrus de cytokines inflammatoires. L'augmentation des cytokines, y compris le facteur de nécrose tumorale alpha (TNF-α) et le facteur de croissance transformant bêta (TGF-β), est liée à la fois à l'inflammation systémique et aux maladies dégénératives liées à l'âge, y compris l'arthrose10,11,12. Il a été démontré que la cytokine pro-inflammatoire TNF-α et la cytokine anti-inflammatoire TGF-β modulent la dynamique du transport moléculaire aux interfaces entre le système circulatoire et divers tissus en contrôlant la perméabilité paracellulaire par la régulation des complexes protéiques des jonctions serrées (TJ)13. L'inflammation aiguë due à un traumatisme et à une exposition à des bactéries/virus entraîne des pics de cytokines.

L'observation des changements relatifs du transport moléculaire, vers et entre le système circulatoire et les tissus articulaires, en réponse aux concentrations dynamiques de cytokines (systémiques et locales), et facilitée par le flux sanguin et de fluide interstitiel, nécessite une imagerie multi-échelle du sub-micro au mésoéchelle, à travers les cellules, les tissus et l'organe articulaire. Ici, nous avons émis l'hypothèse que des modifications aiguës des cytokines immunomodulatrices modifient les propriétés de barrière fonctionnelle aux interfaces tissulaires entre les tissus des systèmes musculo-squelettique et circulatoire. Pour tester cette hypothèse, nous avons quantifié les modifications du transport moléculaire dans et entre les compartiments tissulaires de l'articulation arthrosique, en utilisant une approche parallèle à notre étude précédente, c'est-à-dire chez des cobayes anesthésiés injectés par le cœur avec un traceur moléculaire de 70 kDa marqué et les cytokines TNF-α ou TGF-β3,14,15,16.

Notre objectif principal était de comprendre les différences globales et locales de perfusion dans les tissus du genou après un pic aigu des cytokines pro-inflammatoires ou anti-inflammatoires respectives, TNF-α ou TGF-β. Tout d'abord, l'intensité moyenne du traceur a été mesurée dans le bloc de tissu entier de chaque animal au sein de chaque groupe ; cette mesure globale de la perfusion de l'articulation du genou comprenait l'articulation et la musculature environnante. Par la suite, l'intensité moyenne du traceur a été comparée entre les compartiments tissulaires de l'articulation, au sein et entre les groupes (témoin traité avec une cytokine et non traité). Enfin, la fonction de barrière à l'interface vasculaire dans les tissus de l'articulation a été mesurée comme la différence entre les compartiments vasculaire et tissulaire des tissus osseux et musculaires.

La perméabilité de grosses molécules telles que l'albumine a été mesurée à l'aide d'un traceur moléculaire fluorescent de 70 kDa, où l'intensité du traceur est directement proportionnelle à la concentration17. Une diminution de l'intensité du traceur indique une diminution de la concentration du traceur et donc une diminution de la perméabilité du traceur ; à l'inverse, une augmentation de l'intensité du traceur indique une concentration accrue du traceur et donc une augmentation de la perméabilité du traceur. Au sein de chaque groupe d'animaux (deux groupes de traitement par cytokines - TNF-α ou TGF-β - et groupe témoin non traité), les différences relatives de concentration de traceur entre les compartiments tissulaires donnent une mesure de la fonction de barrière entre les tissus respectifs.

Pour tester l'hypothèse selon laquelle la co-délivrance du traceur de 70 kDa avec la cytokine (TNF-α ou TGF-β) module le transport moléculaire (perméabilité ou pénétration tissulaire), l'intensité moyenne du traceur a d'abord été comparée entre le contrôle et chacun des groupes expérimentaux de cytokines en utilisant une ANOVA unidirectionnelle avec des tests post-hoc de Tukey (Fig. 1). Les groupes TGF-β et TNF-α présentaient une intensité moyenne significativement plus faible que le groupe témoin (p < 0,05). Aucune différence significative n'a été observée entre les groupes de traitement par cytokines.

Intensité moyenne du traceur de 70 kDa dans l'ensemble du bloc tissulaire contenant l'articulation et la musculature environnante. Les barres d'erreur indiquent l'erreur standard de la moyenne (n = 3). * Les différences significatives ont été déterminées par ANOVA unidirectionnelle avec l'analyse post hoc de Tukey, où la signification statistique est définie par p < 0,05.

Les rendus tridimensionnels (3D) de l'ensemble du volume articulaire (Fig. 2A) ont montré des différences relatives grossières dans la distribution du traceur de 70 kDa. Celles-ci ont été confirmées par une mesure quantitative de l'intensité moyenne du traceur dans différents compartiments tissulaires de l'articulation et entre les compartiments extra- et intravasculaires des tissus respectifs, qui donnent des mesures quantitatives de la fonction de barrière tissulaire.

Une augmentation aiguë des cytokines circulantes perturbe la fonction de barrière entre les compartiments tissulaires par rapport aux témoins. La fonction de barrière est la plus élevée entre les compartiments tissulaires avec les différences les plus élevées (significatives) dans la concentration du traceur. (A) Rendu 3D montrant la distribution brute du traceur dans l'articulation. Dans le groupe témoin (panneau de gauche), l'intensité du traceur était nettement plus élevée dans l'espace osseux, cartilagineux et médullaire par rapport à la musculature environnante, le traceur apparaissant également dans les ligaments. Le cartilage, l'os et les ligaments sont apparus jaune-vert en raison de la co-localisation du traceur (fluorescence exogène, rouge) et de l'autofluorescence du tissu (fluorescence endogène du collagène, vert). La musculature environnante présentait peu ou pas de fluorescence, les fascias musculaires limitrophes présentant des niveaux quelque peu élevés de traceur. Contrairement au groupe témoin et au groupe TGF-β, le groupe TNF-α (panneau du milieu) a montré les niveaux grossièrement apparents les plus élevés de traceur, à la fois dans les fascias musculaires qui délimitent nettement le compartiment musculaire, ainsi que dans le système vasculaire musculaire. . De plus, contrairement au groupe témoin, les groupes TNF-α et TGF-β présentaient moins de traceur dans le cartilage, le ligament et l'os, qui apparaissaient presque exclusivement verts (c'est-à-dire présentant une autofluorescence mais peu ou pas de traces de traceur rouge). De même, de faibles niveaux de traceur ont été observés dans l'espace médullaire. Le groupe TGF-β présentait des schémas similaires de traceur, bien que beaucoup moins d'intensité de fluorescence rouge dans le muscle (panneau de droite). L'autofluorescence des tissus (vert) et le traceur fluorescent de 70 kDa (rouge) donnent un signal jaune lorsqu'ils sont colocalisés. (Aperçu B) Comparaison de la concentration moyenne de traceur dans les compartiments tissulaires de tous les groupes. Un pic de TNF-α entraîne une diminution significative de la concentration du traceur dans l'os, le cartilage et la moelle. Un pic de TGF-β entraîne une diminution significative de la concentration du traceur dans le cartilage et la moelle. En tenant compte de chaque groupe spécifique, y compris les groupes contrôle (B1), TNF-α (B2) et TGF-β (B3), des différences de concentration de traceurs plus significatives sont observées entre les compartiments tissulaires du groupe contrôle (B1) que les groupes expérimentaux. groupes (B2, B3). Par rapport aux barrières fonctionnelles intactes aux interfaces entre les tissus du groupe témoin, la fonction barrière apparaît réduite dans le groupe TGF-β et complètement abrogée dans le groupe TNF-α. Les barres d'erreur indiquent l'erreur standard (n = 3). Les tests de Shapiro-Wilk ont montré que les données quantitatives étaient normalement distribuées. Des différences significatives ont été déterminées par ANOVA bidirectionnelle et l'analyse post hoc de comparaisons multiples de Sidak. Signification statistique indiquée respectivement par *, **, ***, **** (p < 0,05, p < 0,01, p < 0,001 et p < 0,001).

Dans le groupe témoin, les concentrations de traceurs étaient les plus élevées (pas significativement différentes) dans les compartiments osseux et cartilagineux. Les compartiments osseux et cartilagineux des articulations du genou témoin présentaient tous deux une concentration de traceurs significativement plus élevée que la moelle osseuse et le compartiment de la moelle osseuse présentait une concentration de traceurs significativement plus élevée que le muscle et les compartiments vasculaires respectifs de l'os et du muscle. Prises ensemble, ces différences significatives dans les concentrations respectives de traceurs entre les compartiments tissulaires du genou témoin indiquent une fonction de barrière de base intacte entre les tissus articulaires du groupe témoin non traité (Fig. 2B1).

Au sein des groupes, les différences de concentration de traceur entre les compartiments tissulaires donnent une mesure de la fonction de barrière entre les compartiments tissulaires respectifs. Pour tester l'hypothèse selon laquelle la co-administration du traceur avec la cytokine, TNF-α ou TGF-β, modifie la quantité et la distribution spatiale du traceur dans les différents compartiments tissulaires de l'articulation, de la musculature environnante et du système vasculaire, les concentrations de traceur ont été comparés entre les compartiments tissulaires segmentés des groupes contrôle, TNF-α et TGF-β. Dans le groupe témoin, les compartiments des tissus osseux, cartilagineux et médullaires présentaient une concentration de traceurs significativement plus élevée que les compartiments tissulaires respectifs des groupes TNF-α et TGF-β, confirmant les observations macroscopiques qualitatives (Fig. 2B1). De plus, les compartiments tissulaires respectifs du groupe témoin ont montré des différences de concentration de traceurs plus statistiquement significatives que celles du groupe TGF-β (Fig. 2B3), et le groupe TGF-β a montré des différences de concentration plus statistiquement significatives que dans les compartiments respectifs du groupe. Groupe TNF-α (Fig. 2B2).

Par conséquent, ces données impliquent la co-administration des cytokines, TNF-α et TGF-β, en modifiant la concentration et la distribution du traceur dans les tissus de l'articulation de sorte que les différences entre les tissus sont réduites, impliquant une perte de la fonction de barrière entre les compartiments tissulaires. Dans le groupe TGF-β, la fonction barrière a été réduite par rapport au groupe témoin. Dans le groupe TNF-α, la fonction de barrière semblait être complètement abrogée, car il n'y avait pas de différences significatives de concentration de traceur entre les compartiments tissulaires de ce groupe.

Pour tester l'hypothèse selon laquelle la co-administration de traceur avec des cytokines, TNF-α ou TGF-β, modifie la fonction de barrière des tissus d'interface, y compris le périoste (entre l'os et le muscle) et l'endothélium vasculaire (compartiments intra- ou extravasculaires), la différence de moyenne la concentration du traceur a été comparée entre les compartiments extravasculaires des tissus osseux et musculaires et leurs compartiments intravasculaires respectifs (vaisseaux sanguins). Il a été démontré que l'administration aiguë de TNF-α ou de TGF-β réduisait la fonction de barrière aux interfaces tissu-vaisseaux. Plus précisément, les différences de transport intra- à extravasculaire du traceur de 70 kDa dans l'os étaient significativement plus importantes dans le groupe témoin que dans le groupe TGF-β, ce qui indique une fonction de barrière intacte. De plus, dans le groupe témoin, la fonction de barrière dans l'os était significativement plus grande et dans une direction opposée dans l'os que dans le muscle. En revanche, les groupes injectés de TNF-α ou de TGF-β n'ont pas montré de différence significative dans la fonction barrière mesurée entre le transport intra- et extravasculaire dans les compartiments tissulaires (Fig. 3).

Fonction de barrière à l'interface vasculaire avec les compartiments tissulaires, notamment osseux et musculaires, dans les groupes témoins ainsi que les groupes TNF-α ou TGF-β. Les os et les muscles présentent des différences significatives d'amplitude et de direction dans la fonction barrière pour le groupe témoin, mais pas pour les groupes TNF-α ou TGF-β, indiquant une réduction de la fonction barrière pour les deux groupes de cytokines. En outre, des différences significatives dans la fonction de barrière entre les compartiments vasculaires et tissulaires de l'os ont été observées entre le groupe témoin et le groupe TGF-β, indiquant une diminution significative de la fonction de barrière entre les vaisseaux sanguins et l'os avec l'administration de TGF-β. Les barres d'erreur indiquent l'erreur standard (n = 3). Des différences significatives ont été déterminées par ANOVA bidirectionnelle et l'analyse post hoc de comparaisons multiples de Sidak. Signification statistique indiquée par * (p < 0,05) et *** (p < 0,001).

Cette étude a cherché à déterminer si des pics de cytokines immunomodulatrices, TNF-α ou TGF-β, induisaient des modifications de la fonction de barrière tissulaire aux interfaces tissulaires au sein de l'articulation du genou de cobayes atteints d'arthrose spontanée liée à l'âge, en utilisant une résolution quasi cellulaire 3D cryo- imagerie d'articulations entières 5 min après la livraison de cytokines et de traceurs fluorescents au cœur. Des changements brutaux et grossièrement observables dans la distribution du traceur de 70 kDa marqués par fluorescence étaient observables dans les rendus macroscopiques des compartiments musculaires périarticulaires, ainsi que du cartilage, de l'os et de l'espace médullaire du complexe articulaire. Dans le groupe témoin, la quantification de la concentration de traceurs dans les compartiments tissulaires des compartiments osseux, cartilagineux, médullaire et musculaire, ainsi que leurs compartiments vasculaires respectifs, a démontré des différences significatives entre plusieurs compartiments, indiquant une fonction de barrière intacte aux interfaces intercompartimentales. Dans le groupe TGF-β, la fonction barrière respective est apparue réduite. La fonction de barrière semblait être complètement supprimée dans le groupe TNF-α, car aucune différence significative dans les concentrations de traceurs n'a été observée entre les compartiments tissulaires mesurés. En outre, des différences significatives dans l'ampleur et la direction du transport du traceur ont été observées entre les compartiments vasculaire et extravasculaire de l'os et du muscle du groupe témoin, indiquant une fonction de barrière intacte et corroborant des études antérieures sur le rôle du périoste en tant que gardien moléculaire entre l'os et le muscle18 .

Les doses de TNF-α et de TGF-β administrées dans l'expérience actuelle représentent une augmentation aiguë (pic) des niveaux de cytokines au-dessus des niveaux (patho-) physiologiques intrinsèques et chroniques attribuables à l'état de la maladie arthrosique d'un animal donné. Le pic équivalent des taux sériques de TNF-α et de TGF-β (5 minutes après l'administration au cœur) a été calculé comme étant de 16,5 ng/ml et 83,25 ng/ml, respectivement. Les taux sériques de base de TNF-α et de TGF-β chez les cobayes sains et OA n'ont pas encore été rapportés. Les taux sériques de cytokines ont été caractérisés dans des modèles induits d'arthrose chez des rongeurs ; les niveaux sériques de TNF-α administrés dans l'expérience actuelle représentent le double des niveaux de base du modèle murin d'arthrose, et les niveaux sériques de TGF-β représentent 62 % des valeurs rapportées19,20. Par conséquent, l'effet de l'administration de cytokines dans la présente étude représente un doublement quasi immédiat du TNF-α et du TGF-β par rapport aux niveaux de base. En tenant compte de cela pour le modèle de cobaye, un doublement quasi immédiat du TNF-α par rapport aux niveaux de référence a semblé abroger complètement la fonction de barrière entre les tissus, alors qu'une augmentation aiguë d'environ 62 % de la fonction de barrière atténuée par le TGF-β entre les tissus à un moindre degré au-dessus de la fonction de barrière de base (groupe témoin). En d'autres termes, un pic plus élevé de concentration de cytokines par rapport aux niveaux de référence était associé à un impact plus important, c'est-à-dire une diminution, de la fonction de barrière entre les tissus.

La littérature publiée rapporte une augmentation de la perméabilité à l'albumine vasculaire avec le TNF-α administré de manière exogène dans des études menées sur un modèle de souris in vivo étudiant plusieurs tissus, notamment les poumons, le foie, les reins, le cerveau, le nerf sciatique, la rétine, le duodénum, le jéjunum, le caecum, l'aorte thoracique , peau et diaphragme21. Contrairement à l'étude aiguë actuelle observant des changements 5 min après l'administration de TNF-α, des augmentations significatives n'ont été observées dans l'étude chez la souris que 12 à 18 h après l'administration de TNF-α. De plus, l'étude publiée sur la souris a administré du TNF-α à 20 ng/g, une dose plus de 30 fois supérieure à celle de l'étude actuelle. Ces différences peuvent également refléter des différences intrinsèques entre le modèle murin sain et le modèle naturel d'arthrose chez le cobaye.

Dans l'étude actuelle, le groupe TNF-α et TGF-β présentait des concentrations significativement plus faibles de traceur dans les tissus musculaires et articulaires, indiquant une diminution de la perméabilité ; cela contraste avec les études in vivo publiées dans lesquelles la réduction de l'activité du TGF-β a diminué la perméabilité de la barrière hémato-encéphalique22. Cependant, il a été démontré que le TGF-β améliore et perturbe la fonction de barrière in vitro dans les cellules épithéliales intestinales, les cellules microvasculaires cérébrales, les cellules épithéliales du côlon, les cellules endothéliales cornéennes et endothéliales, les cellules épithéliales alvéolaires et les cellules de Sertoli, respectivement23,24,25, 26,27,28. Dans les cellules épithéliales orales, il a été démontré que le TGF-β diminue puis augmente la perméabilité de la barrière fonctionnelle29. Des expériences in vivo ont démontré une perméabilité tissulaire systémique accrue aux petites molécules, 1,8 kDa, après fracture30. Des taux élevés de TGF-β sérique ont également été détectés en réponse à une fracture31. Pris dans son ensemble, l'effet de la modulation de la barrière fonctionnelle du TGF-β peut dépendre du tissu, du temps et de la taille moléculaire.

La diaphonie os-muscle, médiée par le périoste, a été associée à d'autres affections tissulaires dégénératives liées à l'âge, à savoir la sarcopénie et l'ostéoporose32,33. Cependant, son rôle dans l'arthrose n'a pas été aussi largement reconnu. Le périoste sert de membrane barrière fonctionnelle enveloppant l'os et d'interface sensible aux stimuli entre l'os et le muscle18,34,35,36. Il convient de noter en particulier qu'il a été démontré précédemment que la fonction de barrière du périoste dépendait de la direction, avec une perméabilité dans la direction os-muscle significativement inférieure à celle dans la direction muscle-os ; ces effets sont sensibles aux stimuli au changement de débit ainsi qu'à la précontrainte, qui sont tous deux des indicateurs immédiats de traumatisme18,35,37. Dans le contexte de l'étude actuelle, une perte de la fonction barrière attribuable à un pic rapide des cytokines TNF-α et TGF-β amplifierait la signalisation via le transport moléculaire du muscle à l'os et vice versa. Par conséquent, le périoste fournit une interface clé entre le système circulatoire et l'articulation. Une comparaison des compartiments tissulaires révèle que le transport de la molécule de 70 kDa vers l'os, le cartilage et l'espace médullaire est significativement perturbé par le TNF-α et le TGF-β ; en revanche, les compartiments musculaire et vasculaire restent largement épargnés. Cela suggère que le périoste module activement le mouvement des macromolécules entre le muscle et l'os en réponse aux cytokines inflammatoires, l'impliquant comme une barrière tissulaire fonctionnelle, encore renforcée par des observations publiées sur l'expression des protéines associées aux jonctions serrées par les cellules dérivées du périoste34.

Il a été émis l'hypothèse que les perturbations de la fonction vasculaire sont liées à l'apparition ou à la progression de l'arthrose, avec un flux sanguin insuffisant provoquant la mort cellulaire dans les tissus de l'articulation38. Chez les animaux témoins, une comparaison de l'os et du muscle, et de leur système vasculaire respectif, révèle des niveaux significativement plus élevés d'intensité moyenne du traceur dans l'os que dans le muscle. Cela suggère que la barrière endothéliale dans l'os a des propriétés de barrière active plus importantes que dans le muscle et/ou que les effets relatifs de drainage des articulations lymphatiques sont potentiellement plus importants dans le muscle que dans le tissu osseux (voir la discussion ci-dessous). La perméabilité de cette barrière endothéliale dans le système vasculaire osseux est également affectée de manière significative par le TNF-α et le TGF-β, impliquant une augmentation des cytokines inflammatoires dans le dysfonctionnement de la barrière vasculaire. La perturbation associée du transport des nutriments, des cytokines et des enzymes protéolytiques vers les cellules et la matrice extracellulaire de l'os et du cartilage, ainsi que les perturbations associées de l'homéostasie tissulaire, peuvent représenter un mécanisme contributif par lequel une inflammation systémique de bas grade conduit à la dégénérescence tissulaire et à la pathogenèse de l'arthrose.

Il n'a pas été possible dans la présente étude d'examiner la concentration de traceur dans les vaisseaux lymphatiques, ce qui peut modifier leur capacité de drainage articulaire en réponse aux cytokines circulantes39,40,41. Il a été démontré que le drainage lymphatique augmente et diminue, respectivement au début et à la progression chronique de l'arthrite, où une inflammation persistante est associée à la destruction de la structure et de la fonction des vaisseaux lymphatiques40. Dans l'étude actuelle, les cobayes sont un modèle spontané d'arthrose, de sorte que leurs tissus sont susceptibles de présenter à la fois des caractéristiques de maladie chronique (avec des diminutions associées du drainage lymphatique) ainsi qu'une exposition à un pic aigu de cytokines TGF-β ou TNF -α (avec augmentation associée du drainage lymphatique) ; de plus, la spécificité du TNF-α et du TGF-β humains vis-à-vis des équivalents cobayes est inconnue. Il faut également considérer que les vaisseaux lymphatiques sont abondants dans le muscle tandis que l'os repose sur le drainage lymphatique à travers le tissu périosté18,36. Avec le développement de nouvelles méthodologies, il pourrait être possible à l'avenir de déchiffrer les effets interdépendants de la fonction de barrière entre le système vasculaire et musculo-squelettique concomitant à la fonction de drainage lymphatique.

Une autre limite à l'étude actuelle est que, bien que le dextrane sélectionné ait un poids moléculaire similaire à l'albumine (70 kDa par rapport à l'albumine de 67 kDa), le dextrane est linéaire contrairement à la structure globulaire de la protéine porteuse albumine. Le transport moléculaire est affecté par la forme, les molécules linéaires présentant des rayons hydrodynamiques plus élevés et entraînant une diffusion plus lente que les molécules globulaires. Par conséquent, le transport de "l'analogue biologique" de dextrane étiqueté à 70 kDa peut représenter une estimation plus élevée du transport équivalent des molécules d'albumine globulaire de 67 kDa, quoique quelque peu contrebalancé par la masse moléculaire légèrement plus élevée et la capacité de "ver à travers" des ouvertures plus petites. De plus, bien que le dextran marqué par fluorescence utilisé dans l'étude actuelle soit de charge neutre, la molécule est polaire car elle est étiquetée « zwitterionique » ; en revanche, l'albumine est chargée négativement. Il a également été démontré que la charge moléculaire a un impact sur le transport moléculaire ; cependant, il a été démontré que la charge n'affecte pas la diffusion des grosses molécules (66 kDa) dans les tissus42. En outre, la cryo-imagerie de bloc permet une imagerie 3D transparente sans précédent des voies de transport à l'intérieur et entre les compartiments tissulaires et les systèmes de l'organisme sur plusieurs échelles de longueur, bien qu'à un moment donné dans un processus hautement dynamique. C'est un avantage pour l'étude actuelle, évaluant les effets d'une augmentation quasi immédiate des cytokines circulantes. Suivi longitudinal et in vivo (par exemple avec des modalités d'imagerie en temps quasi réel3,32,43), les expériences permettraient de mieux comprendre la dynamique du transport ainsi que les effets des augmentations aiguës à chroniques des cytokines, imitant les tempêtes de cytokines à l'inflammation systémique, sur le déroulement temporel des modèles de trafic moléculaire entre les systèmes circulatoire et musculo-squelettique.

La présente étude implique en outre des changements aigus dans les cytokines pour des changements quasi immédiats dans la fonction de barrière aux interfaces entre les tissus des systèmes circulatoire et musculo-squelettique. Il pourrait être possible à l'avenir d'exploiter cette réduction de la fonction barrière pour cibler l'administration de produits pharmaceutiques aux cellules habitantes, dans le cartilage (chondrocytes) et l'os (ostéoblastes, ostéocytes), pour réparer et reconstruire les tissus ravagés par des maladies dégénératives telles que l'OA44. Bien que les effets temporels n'aient pas été spécifiquement abordés par la présente étude, dans un contexte d'inflammation systémique de bas grade dans l'arthrose, l'augmentation aiguë des cytokines TNF-α et TGF-β semble perturber immédiatement la fonction de barrière aux interfaces tissulaires et vasculaires. En outre, l'étude démontre la capacité d'immunomodulation des propriétés de barrière qui existent entre les compartiments tissulaires, étendant le rôle de la diaphonie dans l'arthrose du cartilage et du sous-chondral à tous les tissus de l'articulation. On ignore actuellement comment la charge mécanique et le transport actif modifient le transport moléculaire dans les tissus articulaires en réponse aux cytokines inflammatoires. Une étude récente suggère une efficacité améliorée grâce à la "livraison directe" de produits pharmaceutiques aux lymphatiques articulaires locaux41. Prises dans leur ensemble, ces études peuvent offrir de nouvelles opportunités pour comprendre la physiologie des articulations et la dégénérescence des tissus, et pour développer des mesures pharmaceutiques et physiques pour prévenir l'apparition et la progression de la maladie.

Ici, nous avons étudié l'effet d'augmentations aiguës des cytokines inflammatoires, sur le transport d'un dextrane marqué à 70 kDa du système cardiovasculaire vers et entre les compartiments tissulaires de l'articulation. un protocole complet des méthodologies décrites en bref ci-dessous peut être trouvé à45.

Le dextrane étiqueté de 70 kDa a été sélectionné sur la base d'expériences précédentes montrant un tamisage moléculaire dans l'os, le ligament et l'ensemble de l'articulation ; de plus, il sert d'analogue pour de grosses molécules telles que l'albumine (67 kDa), la protéine porteuse la plus courante dans le sang et fondamentale pour faciliter ce transport1,3,4,5,46,46,48. Le cobaye Dunkin-Hartley est un modèle bien établi pour l'arthrose spontanée liée à l'âge du genou et d'autres articulations synoviales, avec des processus physiopathologiques reflétant l'arthrose primaire chez l'homme3,4,14,15,16. Des expériences ont été réalisées sur des cobayes mâles Dunkin-Hartley (Charles River) à maturité squelettique (11 à 13 mois), qui ont montré dans une étude précédente de notre groupe qu'ils présentaient un phénotype OA comprenant plusieurs ostéophytes ainsi que de grandes zones de perte de cartilage avec des os marqués. érosion du cartilage sur l'os4.

La préparation, l'administration et le temps de circulation de cinq minutes du traceur fluorescent ont été effectués selon les méthodes décrites précédemment4,5,48. Le TNF-α humain recombinant (R and D Systems, Minneapolis, MN) a été dissous dans une solution saline stérile à 0,9 % et ajouté au bolus mélangé à une dose de 0,66 ng/g de poids corporel avant l'administration au cœur des cobayes anesthésiés. Le TGF-ßl humain recombinant (R&D Systems, Minneapolis, MN ; appelé TGF-ß dans le texte pour plus de simplicité) a été préparé de manière similaire à une dose de 3,33 ng/g de poids corporel.

Cette étude a été menée conformément aux directives et réglementations ARRIVE. Les méthodes ont été menées conformément aux directives et réglementations en vigueur. L'étude a été approuvée par l'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) de l'Université Case Western (Protocole #2012-0100). Trois groupes d'animaux (n = 3) ont été anesthésiés à l'isoflurane ; après sédation appropriée, un dextrane étiqueté rouge Texas de 70 kDa de charge neutre (Life Technologies, Carlsbad) seul (témoin) ou avec TNF-α ou TGF-β, a été injecté par le cœur en un seul bolus mixte. Après avoir laissé circuler cinq minutes, les animaux ont été euthanasiés alors qu'ils étaient encore sous anesthésie. Après l'euthanasie, les articulations du genou ont été immédiatement réséquées, puis ostéotomisées en proximal et en distal, en prenant soin de ne pas endommager la musculature environnante. Le joint a ensuite été congelé par immersion dans de l'azote liquide et un composé de température de coupe optique intégré pour une cryo-imagerie haute résolution.

Les blocs de tissus entiers inclus dans l'OCT ont été sectionnés et imagés tous les 40 μm avec le système de cryo-imagerie automatisé CryoViz ™ (BioInvision Inc., Cleveland, OH), permettant une résolution tridimensionnelle quasi unicellulaire des fluorophores dans les spécimens mésoscopiques49. Les images en fond clair et en fluorescence (502–543 nm et 603–664 nm) ont été acquises à 10,2 × 10,2 μm en résolution plane. Les compartiments tissulaires ont été segmentés manuellement et l'intensité de fluorescence moyenne de la région d'intérêt a été utilisée comme mesure de la perméation du traceur.

GraphPad Prism 8 (GraphPad Software, San Diego, Californie, États-Unis) a été utilisé pour l'analyse statistique, avec rapport des moyennes et des erreurs standard. Nous avons utilisé une analyse statistique ANOVA unidirectionnelle et l'analyse post hoc de Tukey pour les comparaisons entre plusieurs compartiments tissulaires. P < 0,05 était considéré comme significatif.

Les ensembles de données générés et/ou analysés au cours de la présente étude sont disponibles dans le référentiel MechBio, https://mechbio.org.

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Les auteurs reconnaissent le soutien du Case Western Reserve Animal Research Center pour la conduite des études sur les animaux en vertu du protocole n ° 2012-0100, modifié en 2014. Nous remercions également le Dr Debashish Roy, PDG de BioInVision, pour les conseils d'experts concernant la conception et déroulement des protocoles de cryoimagerie. Nous remercions également l'installation d'imagerie biomédicale de l'UNSW pour son soutien à l'imagerie confocale et aux études d'analyse d'images associées. L'étude a été soutenue en partie par la dotation de la Paul Trainor Chair Foundation, le Blue Mountains World Interdisciplinary Innovation Institute et les National Institutes of Health.

Équipe MechBio, Graduate School of Biomedical Engineering, University of New South Wales, Sydney, Australie

Lucy Ngo

Blue Mountains World Interdisciplinary Innovation Institute, Nouvelle-Galles du Sud, Australie

Melissa L. Knothe Tate

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Conception et conduite d'expériences sur le cobaye : MKT Conception d'études d'imagerie : MKT, LN Conduite d'études d'imagerie : MKT et BioInvision (cryo-imagerie épiscopique), LN (imagerie confocale). Segmentation d'image : LN Collecte de données : LN, MKT Image et analyse de données : LN, MKT, Interprétation des données : LN, MKT Rédaction du manuscrit : LN, MKT Révision du contenu du manuscrit : LN, MKTMKT et LN assument la responsabilité de l'intégrité de l'analyse des données. Tous les auteurs ont examiné le manuscrit.

Correspondance à Melissa L. Knothe Tate.

Tous les auteurs déclarent qu'il n'y a pas d'intérêts concurrents en ce qui concerne le sujet de cet article. Aux fins de la divulgation complète, MLKT est cofondateur et exerce des fonctions d'administrateur et de conseiller scientifique et technique dans plusieurs entreprises en démarrage dans les domaines de la médecine clinique et régénérative. MLKT est un inventeur nommé sur plusieurs brevets dans les domaines de la chirurgie et de la médecine régénérative.

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Réimpressions et autorisations

Ngo, L., Knothe Tate, ML Un pic de cytokines circulantes TNF-α et TGF-β modifie la fonction de barrière entre les tissus vasculaires et musculo-squelettiques. Sci Rep 13, 9119 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-30322-7

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Reçu : 10 février 2022

Accepté : 21 février 2023

Publié: 05 juin 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s41598-023-30322-7

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