Nouveau modèle de corticale

Rapports scientifiques volume 13, Numéro d'article : 7809 (2023) Citer cet article

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Les organoïdes corticaux humains (hCO), dérivés de cellules souches pluripotentes induites humaines (iPSC), fournissent une plate-forme pour interroger les mécanismes du développement du cerveau humain et des maladies dans les tissus tridimensionnels complexes. Cependant, les méthodes actuelles de développement de hCO manquent de tissus non neuronaux importants, tels que la couche méningée environnante, qui se sont révélés essentiels à la corticogenèse normale et au développement cérébral. Ici, nous avons d'abord généré des hCO à partir d'une seule rosette pour créer des organoïdes plus homogènes avec une taille constante d'environ 250 µm au jour 5. Nous avons ensuite profité d'un système de co-culture 3D pour encapsuler des organoïdes cérébraux avec une fine couche de cellules méningées du très premiers stades du développement cortical. Une analyse d'immunomarquage a été réalisée pour afficher différents marqueurs de la couche corticale au cours des différents stades de développement. La surveillance en temps réel du développement des organoïdes à l'aide d'IncuCyte a affiché une morphologie améliorée et un taux de croissance accru au fil du temps. Nous avons constaté que les organoïdes encapsulés dans les méninges illustraient une meilleure organisation laminaire en présentant une expression plus élevée de REELIN par les neurones de Cajal-Retzius. La présence de cellules méningées a entraîné une plus grande expansion des cellules progénitrices intermédiaires TBR2 (IPC), de la couche corticale profonde (CTIP2) et de la couche corticale supérieure (BRN2). Enfin, les organoïdes encapsulés dans les méninges ont amélioré la formation radiale externe de la glie et des astrocytes, illustrée par une expression plus forte des marqueurs HOPX et GFAP, respectivement. Cette étude présente une nouvelle plate-forme de co-culture 3D pour imiter plus étroitement la structure cérébrale corticale in vivo et nous permettre de mieux étudier les mécanismes sous-jacents aux troubles neurodéveloppementaux au cours du développement embryonnaire.

Le cerveau humain est composé de plusieurs types de cellules, dont les neurones, les astrocytes, la microglie et les oligodendrocytes. Les systèmes organoïdes cérébraux actuels dérivés de cellules souches pluripotentes fournissent d'importants modèles in vitro pour récapituler le développement du cortex humain, nous permettant d'étudier le développement du cerveau dans des conditions saines et malades1,2,3,4,5. Cependant, il existe plusieurs limites aux systèmes de modèles in vitro actuels qui peuvent affecter leur reproductibilité et leur applicabilité. L'une de ces limitations est la variabilité d'un lot à l'autre qui peut survenir en raison de différences dans les populations de cellules de départ, les conditions de culture et les propriétés d'auto-organisation des cellules6,7. Il est crucial de remédier à cette limitation pour développer des organoïdes en tant que modèles fiables pour étudier le cerveau humain. L'introduction d'une approche basée sur une seule rosette nous a permis de générer des organoïdes plus cohérents et reproductibles, ce qui donne des organoïdes plus homogènes et définis qui imitent mieux les aspects du développement précoce du cerveau.

Une autre limitation du modèle organoïde est le manque de diversité cellulaire complète observé dans le cerveau humain8. Alors que les organoïdes peuvent générer certains des types de cellules trouvés dans le cerveau humain, tous les types de cellules ne sont pas représentés. Cela peut limiter la transduction de signal appropriée nécessaire pour récapituler pleinement les aspects développementaux et architecturaux du cerveau humain avec une complexité appropriée. Pour surmonter cette limitation, notre approche consiste à incorporer les cellules méningées comme un type de cellule important qui joue un rôle central dans le développement du cerveau. Les méninges, un type de cellule cérébrale non neuronale, sont présentes dès les premiers stades embryonnaires du développement cortical et semblent nécessaires à la corticogenèse normale et à la formation de la structure cérébrale9,10,11,12. Des études récentes ont identifié une niche non parenchymateuse de la population de NSC au sein des méninges qui expriment des marqueurs précurseurs neuronaux capables de générer de nouveaux neurones in vitro et in vivo13,14. Au cours du développement cérébral, les méninges jouent un rôle crucial dans le développement de hCO en libérant divers facteurs morphogéniques nécessaires à la corticogenèse. Des études in vitro ont montré que les cellules méningées peuvent sécréter du FGF-215, de l'IGF216,17, du CXCL1218,19,20,21 et de l'acide rétinoïque22,23,24 qui sont essentiels au bon fonctionnement de la corticogenèse. Des études in vivo ont également démontré que les méninges sécrètent une multitude de molécules de signalisation, dont Sonic hedgehog (Shh), qui joue un rôle clé dans le développement du cerveau antérieur ventral, et la famille des protéines morphogénétiques osseuses (BMP), qui régule la fonction dorso-ventrale. structuration du tube neural25. D'autres facteurs sécrétés par les méninges comprennent les membres de la famille des facteurs de croissance des fibroblastes (FGF), Wnt et Notch, qui sont impliqués dans la régulation de la prolifération, de la différenciation et de la survie cellulaires dans divers processus de développement, y compris la neurogenèse1,26,27,28, 29. On suppose que les zones enrichies en laminine dans les méninges sont essentielles pour réguler la libération de ces facteurs. Par conséquent, la présence de méninges semble être cruciale pour le développement des organoïdes cérébraux30.

La méthode de co-culture pour combiner différentes régions du cerveau au sein d'un seul tissu organoïde a déjà été montrée pour modéliser les interactions complexes entre différentes régions et étudier les défauts de développement neurologique31. Par exemple, en utilisant des reporters fluorescents, il a été démontré que les interneurones GABAergiques dépendants de CXCR4 migrent du prosencéphale ventral vers le prosencéphale dorsal, ce qui a été utilisé pour étudier des maladies neurologiques et tester des thérapies potentielles32. Cependant, personne n'a étudié l'utilisation de cellules méningées en combinaison avec des organoïdes cérébraux pour étudier l'effet de ces cellules sur le développement des organoïdes cérébraux. Dans cette étude, nous avons profité d'un système de co-culture pour générer des organoïdes cérébraux corticaux en combinaison avec des cellules méningées et étudié le rôle des cellules méningées dans la progression de l'organisation laminaire du développement précoce du cerveau dans un système modèle.

Trois lignées cellulaires de cellules souches pluripotentes induites (iPSC) ont été utilisées dans cette étude. CC1 et CHD2 ont été obtenus à partir de biopsies cutanées de différents individus et PCDH19-WT (fibroblastes de prépuce disponibles dans le commerce) ont été précédemment générés par des membres du laboratoire et20,21. Toutes les lignées cellulaires iPSC ont été menées avec l'approbation préalable de l'Institutional Review Board of Michigan Medicine. Les iPSC ont été cultivées sur une dilution au 1:200 d'une boîte de 30 mm revêtue de Geltrex (Fisher Scientific) et dans TeSR™-E8™ (StemCell Technologies). Les cellules ont été soumises à des passages de routine une fois par semaine et ont été utilisées avant le 35e passage pour toutes les expériences.

Les cellules méningées humaines sont dérivées directement de leptoméninges humaines et sont disponibles dans le commerce (catalogue ScienCell #1400). Les cellules leptoméningées ont été cryoconservées au premier passage et livrées congelées. Chaque flacon contient > 5 × 105 cellules dans un volume de 1 ml. Les CMH ont été caractérisées par immunofluorescence ; ils sont tous positifs pour la fibronectine et négatifs pour la GFAP et l'actine α-musculaire lisse. 5 × 105 cellules/ml, ont été achetées (1 ml/flacon) au passage zéro, expansées dans un milieu de cellules méningées MenCM composé de 500 ml de milieu de base, 10 ml de sérum de veau fœtal et 5 ml de supplément de croissance de cellules méningées et 5 ml de pénicilline/streptomycine (catalogue ScienCell n° 1404) et ont été utilisés jusqu'au troisième passage.

Pour générer des organoïdes corticaux, des iPSC indifférenciés ont été utilisés à la confluence de 70 à 80 %. Pour commencer la préparation de la plaque, 30 µl de Geltrex concentré à 100 % ont été déposés au milieu de chaque puits d'une plaque à 12 puits et laissés dans l'incubateur pendant 20 min pour se solidifier sous forme de bulle. Ensuite, du Geltrex dilué dans du DMEM/F12 (1:100) a ensuite été utilisé pour recouvrir le reste de la surface autour de la bulle de Geltrex. Les cellules iPSC ont ensuite été dissociées des plaques revêtues de Geltrex par Accutase (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), et 8 × 105 cellules dans le milieu TeSRTM-E8TM ont été ajoutées autour de la bulle et non directement dans la bulle et laissées dans l'incubateur pendant 24 h pour régler. Ensuite, le milieu cellulaire a été remplacé par du milieu d'induction neurale 3N vitamine A contenant 1 uM de dorsomorphine et 10 uM de SB431542 comme décrit dans 22 avec quelques modifications. (Détails du milieu 3N indiqués dans le tableau de données supplémentaires 1). Le milieu a été remplacé tous les jours par 2 ml de milieu frais. Après 24 h, des rosettes simples ont commencé à apparaître près de la bulle de Geltrex, la taille des rosettes observées augmentant chaque jour. Les rosettes simples les plus proches de la bulle solide Geltrex étaient visiblement plus grandes que les autres rosettes. Après 5 jours, ces rosettes simples plus grandes ont été prélevées manuellement et transférées individuellement dans des puits simples d'une plaque à fond rond à 96 puits avec un milieu d'induction neurale de 3N + vitamine A. Le milieu a été rafraîchi tous les deux jours, pendant 3 jours.

Le quatrième jour après le passage cellulaire, les cellules méningées ont été détachées à l'aide d'Accutase (Innovative Cell Technologies) et ajoutées à des rosettes individuelles en suspension (iPSC cell day 8?). Pour déterminer le nombre optimal de cellules méningées à co-incuber avec des cellules iPSC, la moitié des puits ont reçu 8 × 103 cellules méningées et une autre moitié est restée sans cellules méningées comme témoin. Le milieu était composé à 50 % de milieu de cellules méningées et à 50 % de 3N + vitamine A. Le milieu méningé contenant 2 % de FBS additionné moitié-moitié de 3N a fait baisser la concentration de FBS à 1 %. Ce milieu contenant du FBS a été ajouté pendant seulement 3 jours (entre les jours 9 à 11) et la même condition a été considérée comme condition de contrôle. Au jour 9, la co-culture d'organoïdes et de cellules méningées a ensuite été ajoutée à un système IncuCyte Zoom (Essen BioScience, Ann Arbor, MI, USA) pour incubation et imagerie. L'imagerie a été obtenue toutes les trois heures pendant les trois premiers jours (jours 9 à 11) puis toutes les huit heures jusqu'au jour 42. À partir du jour 12, le milieu a été rafraîchi une fois/jour avec 3N + vitamine A + 10 ng/ml BDNF + 10 ng/ml NT3. À la fin du jour 42, les organoïdes ont été transférés dans des plaques à fond rond à 48 puits, avec le même milieu et placés dans l'incubateur sans IncuCyte, en raison des limitations de taille d'image IncuCyte. Les organoïdes ont été fixés respectivement aux jours 42, 56 et 70 pour une analyse d'imagerie plus approfondie.

Les organoïdes ont été fixés dans du paraformaldéhyde froid à 4 % (PFA) dans une solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco (DPBS) pendant 20 min, puis lavés deux fois dans du PBS pendant 5 min. Les organoïdes fixes ont ensuite été incubés pendant une nuit à 4 ° C dans du saccharose à 30 % dans du PBS. Le lendemain, les organoïdes ont été retirés du saccharose et intégrés et congelés dans un composé à température de coupe optimale Tissue-Tek (OCT, Sakura), cryo-sectionnés à une épaisseur de 20 µm et collectés sur des lames Superfrost Plus (Fisher Scientific). Les lames ont été rincées avec 0,1 % de Triton-X100 (Sigma) pendant 20 min à température ambiante pour augmenter la perméabilité et les coupes ont ensuite été incubées dans un tampon de blocage ICC (PBS avec 0,05 % de Tween-20, 5 % de sérum de chèvre normal et 1 % de BSA ) pendant 1 h à température ambiante. Ensuite, les sections ont été incubées avec des anticorps primaires pendant une nuit à 4 ° C. Les espèces d'anticorps, la dilution, le nom du fournisseur et les numéros de catalogue sont inclus dans le tableau de données supplémentaires 2. Les cellules ont ensuite été lavées avec du PBST (0,05 % de Tween 20 dans du PBS) trois fois pendant 10 min chacune, puis incubées avec des anticorps secondaires dilués dans la solution de blocage pendant 90 minutes à température ambiante. Les lames ont ensuite été lavées une fois avec du PBST pendant 10 min et incubées pendant 5 min dans du PBS avec du bisbenzimide pour marquer les noyaux. Enfin, les lames ont été lavées trois fois pendant 10 min chacune dans du PBST, puis montées dans un milieu de montage Glycergel, imagées à l'aide de la microscopie confocale (décrite ci-dessous) et laissées sécher pendant la nuit pour une imagerie supplémentaire.

Le système IncuCyte Zoom est une plate-forme qui permet l'imagerie en temps réel de sphéroïdes en utilisant une fluorescence sans étiquette ou bicolore pour observer la morphologie et étudier la croissance des sphéroïdes au fil du temps. Ici, le système surveillait la croissance des rosettes. La morphologie et la section transversale moyenne de chaque organoïde à différents moments de la différenciation ont été observées et analysées à l'aide du logiciel du système IncuCyte Zoom. Toutes les données IncuCyte ont été obtenues à partir de cinq expériences indépendantes avec au moins six échantillons dans chaque condition.

Les coupes ont été examinées avec un microscope confocal à balayage laser Leica TCS SP5 droit + système inversé (Leica Microsystems, Mannheim, Allemagne) en utilisant une procédure de balayage séquentiel. Les images confocales ont été prises avec des objectifs 10 × et 20 × et les données ont été analysées par ImageJ. Les images confocales ont été acquises à l'aide de microscopes confocaux Zeiss LSM 700, LSM 780 ou Zeiss LSM 800 équipés d'une platine motorisée et d'un logiciel Zen black ou blue edition. Les images en mosaïque ont été assemblées à l'aide du module Zen Tiles and Positions. Pour l'imagerie en fond clair, un microscope EVOS (Advanced Microscopy Group) a été utilisé. Toutes les images ont été compilées dans Adobe Photoshop, avec des ajustements d'image appliqués à l'image entière et limités à la luminosité, au contraste et aux niveaux. Les images présentées dans les figures à titre de comparaison ont été obtenues et traitées en parallèle en utilisant des paramètres identiques.

Prism version 8.4.2 (GraphPad) a été utilisé pour toutes les analyses statistiques. Pour toutes les autres études, la différence significative entre les groupes de test a été évaluée à l'aide d'un test t de Student bilatéral non apparié. Une valeur AP < 0,05 était considérée comme statistiquement différente. Ces expériences ont été répétées quatre fois avec trois lignées cellulaires différentes. (CC1 n = 2, PCDH19 n = 1 & CDH2 n = 1). Des immunomarquages ont été réalisés pour chacun d'entre eux. Bien qu'il y ait eu de légères différences de taille d'organoïde avec différentes lignées cellulaires, comme indiqué dans les données supplémentaires S1, toutes les lignées cellulaires ont illustré la même tendance dans les stades de différenciation et différents marqueurs. Dans cette étude, des données ont été recueillies et utilisées à partir des trois lignées cellulaires. Au moins n = 4 organoïdes ont été sélectionnés dans chaque expérience (n = 4 répétitions biologiques au total et n = 12 nombre d'organoïdes qui sont mentionnés en détail dans les légendes des figures). Ainsi, chaque graphique représente la moyenne et l'écart type après analyse de 18 organoïdes individuels.

Toutes les expériences et méthodes ont été réalisées conformément aux directives et réglementations en vigueur. Le consentement éclairé a été obtenu de tous les sujets et toutes les méthodes ont été appliquées conformément aux directives et réglementations pertinentes du REC.

Nous avons conçu une méthode pour générer des structures de rosettes neurales uniques à partir des trois CSPi (CC1, PCDH19-WT, CHD2) pour reproduire la région corticale du cerveau. Les rosettes neurales par elles-mêmes n'ont pas la capacité de s'organiser dans l'espace en couches neuronales distinctes, mais elles sont le point de départ de l'organoïde cérébral 3D et peuvent être des proxys utiles pour identifier les cellules potentiellement favorables aux systèmes de co-culture. Pour différents facteurs de croissance et inhibiteurs, nous avons modifié les méthodes décrites par Yichen Shi33. En bref, les iPSC ont été traités avec une double inhibition SMAD (dorsomorphine et SB431542), qui est une méthode bien établie pour dériver des cellules progénitrices neurales à partir des iPSC. Un diagramme schématique de la méthode de culture est montré dans (Fig. 1a). Des rosettes simples ont commencé à s'élever à partir du deuxième jour près de l'interface entre la bulle Geltrex solide et le Geltrex/DMEM dilué (Fig. 1b) et se sont développées avec le temps. Les données ont été tirées de quatre expériences indépendantes sur des cellules CC1 marquées au GFP (Fig. 1d) et le nombre total de n = 18 rosettes a été analysé. Le diamètre moyen de la rosette pour la lignée cellulaire CC1 au jour 2 était de 170 ± 20 µm et a augmenté à> 250 µm au jour 5 (Fig. 1c). L'observation morphologique a montré des structures lumineuses bien définies au milieu des rosettes (Fig. 1c, g). Dans l'ensemble, les rosettes simples avaient > 1,8 fois plus de taille du jour 3 au jour 5, ce qui s'est avéré significatif (p < 0005). (Fig. 1f). Ces données ont été confirmées avec deux lignées iPSC supplémentaires (PCDH19 et CHD2). Les données de ces deux lignes sont présentées dans (Fig. S1 supplémentaire). Pour caractériser l'émergence de la rosette neurale, nous avons effectué une analyse temporelle sur différents marqueurs de cellules souches/progénitrices neurales (NPC). Seulement 2 jours après la double induction SMAD, les rosettes dérivées d'iPSC ont commencé à montrer l'expression des marqueurs neuroectodermiques PAX6 et NESTIN NPC et du marqueur membranaire apical PKC-Z (Fig. 1e1). Au jour cinq, une structure de type neuroépithéliale polarisée bien définie a été observée avec une expression distincte des PNJ PAX6 et NESTIN dans la zone ventriculaire (VZ) et une forte expression des marqueurs de jonction adhérents de N-Cadhérine et PKC-Z dans la région apicale qui ressemblait à tubes neuraux (Fig. 1e2, g).

Génération et caractérisation de rosettes neurales uniques. (a) Diagramme schématique de la méthode de culture pour générer des organoïdes corticaux humains, (b) émergence et croissance de rosettes uniques sur cinq jours à l'interface entre la bulle et le Geltrex dilué, (c) l'image représentative d'une seule rosette illustre la taille moyenne de chacun rosette unique d'environ 255 µm, (d) image représentative des rosettes marquées au GFP, (f) analyse quantitative de la croissance de la rosette unique en micromètres du deuxième au cinquième jour. Les données sont représentées sous forme de moyenne ± SD. L'analyse statistique a montré une différence significative de taille entre les jours 3 à 4 et 4 à 5 (****p < 001, n = 4 expériences indépendantes et n = 4 rosettes ont été sélectionnées dans chaque expérience), (e1,e2) Immunomarquage de rosettes simples au jour 2 et au jour 5 pour les PNJ (PAX6 et NETIN) et la membrane apicale (NCAD/APKC), (g) les rosettes simples expriment PAX6 et la N-cadhérine, barre d'échelle 100 µm, et (h) IncuCyte Zoom images représentatives de croissance organoïde dans des plaques à 96 puits à différents moments du jour 9 au jour 22. (i) Quantification de la taille des rosettes simples après que les rosettes se sont acclimatées à leur environnement 3D, à partir du jour 9 (n = 3 expériences indépendantes à partir de lignées cellulaires CC1 et n = 9 organoïdes au total). Barres d'erreur ± SD. Barre d'échelle 400 µm.

Des rosettes simples ont été transférées dans des plaques à fond rond à 96 puits au jour 5 et les changements morphologiques ont été analysés sur 14 jours à l'aide du système IncuCyte Zoom. Des images ont été prises de chaque rosette toutes les 12 h. Les rosettes ont démontré une croissance de taille au fil du temps, les rosettes quadruplant presque la section transversale des jours 9 à 24 (Fig. 1h). La quantification de la taille des rosettes simples après que les rosettes se sont acclimatées à leur environnement 3D, à partir du jour 9, a montré une augmentation du diamètre de taille autour de > 800 µm au jour 24 (Fig. 1i). Notre approche pour générer des organoïdes corticaux à partir de rosettes simples semble produire rapidement des organoïdes homogènes et produire des rosettes neuroépithéliales organisées bien définies.

Pour évaluer plus avant le protocole, nous avons examiné si notre méthode pouvait générer différentes régions corticales et récapituler le cortex fœtal humain (Fig. 2b). Nous avons effectué une analyse immunohistochimique de marqueurs corticaux spécifiques à différents moments. Au jour 21, nous avons observé une expression claire des marqueurs neuro-progéniteurs PAX6 et BLBP, du marqueur du cerveau antérieur FOXG1 et l'émergence du marqueur neuronal TUJ1 (Fig. 2a). Des études antérieures ont montré TBR2 comme un facteur critique pour la spécification des cellules progénitrices basales intermédiaires (IPC) dans un cortex en développement. TBR2 est connu pour réguler la morphogenèse de chaque couche corticale34,35,36. Au jour 42, les cellules de l'organoïde se sont séparées en progéniteurs PAX6 distincts dans VZ avec des IPC TBR2 proéminents dans la zone sous-ventriculaire (SVZ) (Fig. 2c). On a également observé au jour 42 des expressions claires du marqueur du cerveau antérieur FOXG1 et du marqueur neuronal TUJ1 (Fig. 2d). De plus, l'expression de MAP2, un indicateur de la population de neurones, a commencé au jour 42 et a augmenté de manière significative (P <0, 005) au jour 70 (Fig. 2e, f).

Immunomarquage pour les marqueurs spécifiques à la région et les identités des cellules neuronales. ( a ) Des rosettes uniques immunodosées au jour 21 ont montré l'expression de marqueurs généraux de la glie radiale (RG) (PAX6 et BLBP), et du marqueur du cerveau antérieur FOXG1 et du marqueur neuronal TUJ1. (b) Expression schématique de différentes régions du cerveau. ( c ) L'immunomarquage des organoïdes au jour 42 a montré une expression claire de RG (PAX6) dans VZ et IPC (TBR2) iSVZ. ( d ) Marqueur du cerveau antérieur FOXG1 et marqueur neuronal TUJ1 identifiés dans le VZ au jour 42. ( e ) Les organoïdes cérébraux ont été co-colorés pour le marqueur neuronal MAP2 et PAX 6 au jour 42 (W6) et 70 (W10). ( f ) La quantification de l'expression de MAP2 a montré une différence significative entre W10 et W8 (P <0, 005), ( g ) Les organoïdes cérébraux ont été co-colorés pour le marqueur neuroépithélial (NESTIN) et le marqueur RG externe (HOPX). (h) La quantification de l'épaisseur relative de HOPX a montré une différence significative entre trois points de temps différents, W6, W8 et W10 (P <0,005), (i) les organoïdes cérébraux ont été co-colorés pour le marqueur neuronal de la couche inférieure (CTIP2) et la couche externe marqueur neuronal (SATB2) aux jours 42, 56 et 70, (j, k) la quantification statistique de l'épaisseur relative de chaque couche s'est avérée significative entre trois points de temps différents, W6, W8 et W10 (P < 0,005). (n = 4 répétitions biologiques au total, n = 2 CC1, n = 1 PCDH19 et n = 1 CHD2, n = 12 nombre total d'organoïdes ont été analysés). Barres d'erreur ± SD. La barre d'échelle est de 100 µm pour toutes les figures.

Nous avons en outre évalué l'expression de HOPX dans notre système de culture cellulaire. Chez l'homme, SVZ, un contributeur clé à la croissance néocorticale humaine, est divisé en sections interne et externe appelées iSVZ et oSVZ, respectivement37. Des études récentes ont montré que la présence de cellules gliales radiales externes (oRGC) est responsable de la génération de la plupart des neurones corticaux dans la couche oSVZ similaire au cortex humain en développement aux semaines de gestation 15-2038. HOPX est l'un des marqueurs caractéristiques importants des oRGCs4,39. Nous avons détecté très peu d'expression de HOPX au jour 42, cependant, une nette émergence de HOPX au jour 56 a été détectée à la fois dans la zone ventriculaire (VZ) et dans la SVZ. Au jour 70, l'expression de HOPX était significativement élargie (P <0, 005) et détectée davantage dans la zone sous-ventriculaire externe (région de type oSVZ) qui semblait être séparée de la région interne de SVZ (iSVZ) (Fig. 2g, h). De plus, au jour 42, il y a une expression claire des neurones marqueurs CTIP2 de la couche inférieure formés au-dessus du VZ et du SVZ ressemblant à la préplaque (PP), dont l'expression a augmenté de manière significative (p < 0,005) du jour 56 (S8) au jour 70 (S10 ) (Fig. 2g). Enfin, le marqueur de couche supérieure SATB2 est apparu vers le jour 42 et a augmenté de manière significative entre S8 et S10 (p <0, 005) (Fig. 2g). Des images agrandies supplémentaires d'organoïdes corticaux humains entiers (hCO) pour tous les marqueurs sont présentées dans les figures supplémentaires. S2 et S3. Ensemble, ces résultats démontrent que notre système organoïde généré à partir de rosettes simples récapitule le développement cortical humain et l'expression modelée de marqueurs de développement humains cruciaux in vivo.

Pour mieux imiter la formation in vitro d'organoïdes corticaux humains, nous avons en outre utilisé des cellules méningées humaines en co-culture avec notre méthode de formation de rosette unique pour explorer l'effet des cellules non neuronales dans le développement du cerveau humain. Pour cette expérience, des cellules méningées de leptoméninges humaines ont été utilisées. Il a été démontré que les cellules méningées sont la source d'indices de développement qui régulent la différenciation et la maturation corticales14. Les signaux provenant de différentes couches méningées se sont également révélés cruciaux pour la formation correcte de différentes régions du cerveau40,41,42. Par exemple, des signaux neurogènes tels que l'acide rétinoïque de la couche méningée moyenne régulent la génération de neurones corticaux22. Nous voulions voir si la co-culture de cellules méningées et la présence d'indices de guidage de ces cellules pouvaient fournir un meilleur échafaudage pour la migration des RG et améliorer la maturation de l'organoïde neuronal en couches distinctes distinctes. À cette fin, nous avons ajouté des cellules méningées unicellulaires (~ 8000) à des rosettes individuelles isolées dans des plaques à 96 puits à fond rond au jour 9 et avons surveillé leur fixation en 2, 3 et 6 h. intervalles par IncuCyte Zoom. Il convient de mentionner que différents nombres de cellules méningées ont été initialement examinés pour définir le nombre optimal de cellules pour ces expériences, et il a été démontré que l'ajout de plus de cellules (16 000, 32 000 et 100 000 cellules méningées) a entraîné des rosettes de plus petite taille, peut-être à cause de la moins d'espace pour la croissance des organoïdes (Fig. S4a, b supplémentaire). Ainsi, 8000 cellules méningées ont été choisies comme nombre optimal de cellules pour co-culture avec des organoïdes. Un diagramme schématique de la procédure expérimentale est montré dans (Fig. 3a). Nous avons observé que la plupart des cellules méningées s'attachent et recouvrent les rosettes simples au cours des 24 premières heures (Fig. 3b1) et (Vidéo supplémentaire 1). La condition de contrôle sans cellules méningées est représentée sur la figure 3b2. Des observations visuelles sur 12 jours ont clairement démontré que les hCO en présence de cellules méningées, que nous avons appelées "hCOM", présentaient une forme sphéroïdale mieux définie et plus arrondie par rapport aux hCO (Fig. 3d) et (Fig. Supplémentaire S5). De plus, la comparaison des deux conditions sur la surveillance en temps réel des organoïdes uniques a montré que davantage de débris étaient libérés du bord des organoïdes dans le milieu en hCO par rapport aux hCOM (flèches rouges Fig. 3b2). Les débris ont été lavés en changeant de support. De plus, une analyse de quantification plus poussée à l'aide du logiciel IncuCyte Zoom a montré que la taille de l'organoïde sur 21 jours a remarquablement augmenté (> 1,5 fois plus) dans les hCOM par rapport aux hCO témoins (Fig. 3c). Les données ont été analysées à partir de quatre expériences distinctes et d'un nombre total de 18 organoïdes pour la lignée cellulaire CC1 et les résultats ont été répliqués avec l'utilisation de deux lignées cellulaires supplémentaires (PCDH19 et CHD2) dans la Fig. S6 supplémentaire. Ensemble, ces résultats montrent que notre nouveau système de co-culture utilisant des CSPi humains et des cellules méningées ensemble peut améliorer efficacement la morphologie et le phénotype de la formation d'organoïdes corticaux et augmenter leur croissance dans un temps spécifique.

Système de co-culture 3D pour la génération d'organoïdes du cerveau humain. (a) Le schéma illustre les principales étapes de la génération d'organoïdes corticaux humains (hCO) à partir d'iPSC et co-cultivés avec des cellules méningées à partir du jour 9. (b1,b2) Images représentatives de la croissance des organoïdes dans IncuCyte Zoom montrant 6 images le jour de coculture (jour 9), et d'autres images aux jours 18 et 21 ainsi que des images représentatives de hCO sans cellules méningées. ( c ) La croissance de la taille des organoïdes à l'aide du logiciel de quantification IncuCyte Zoom a illustré une différence remarquable dans la croissance des organoïdes entre le jour 5 et le jour 23. ( d ) Image représentative pour montrer la morphologie des hCOM vs hCO à l'aide d'un microscope à fond clair, barre d'échelle 400 µm (n = 4 répétitions biologiques au total, n = 2 CC1, n = 1 PCDH19 et n = 1 CHD2, n = 12 nombre organoïdes ont été analysés). Les flèches rouges identifient les débris emportés lors du changement de support. La barre d'échelle est de 400 µm pour les images en fond clair.

Pour comparer davantage les organoïdes corticaux dans les hCO vs hCOM, nous avons effectué une analyse de l'expression des marqueurs pour différents sous-types neuronaux à différents moments. À la fin des semaines 6 et 10, nous avons observé que davantage de neurones exprimaient le marqueur de neurones corticaux de couche profonde CTIP2 dans une zone plus étendue des hCOM par rapport aux hCO (Fig. 3a) et les mesures de quantification ont montré que cette différence était significative après 10 semaines (Fig. .4b). À la fin de la semaine 6, nous avons également observé des structures de type VZ bien définies avec des PNJ PAX6 emballés près de la lumière et des IPC TBR2 formés au-dessus de la VZ, rappelant la pré-plaque (PP) dans le développement cortical humain dans les hCO et les hCOM. . Cependant, les IPC TBR2 étaient significativement plus étendus dans les hCOM (P <0, 005) (Fig. 4). Il a été démontré que BRN2 joue un rôle crucial dans le positionnement des neurones néocorticaux35 et est un marqueur des neurones externes de la couche III. Après avoir observé l'expansion accrue des cellules progénitrices basales dans la région SVZ, nous avons en outre évalué l'élargissement des neurones exprimant BRN2 et nous avons constaté qu'il était significativement élargi dans les hCOM par rapport aux hCO. (p < 0,005) (Fig. 4e, f). Les images agrandies de chaque figure sont présentées dans les figures supplémentaires S2 et S3. Ensemble, nos données révèlent que les organoïdes corticaux cultivés dans notre nouveau système de co-culture 3D illustrent une stratification corticale bien définie.

Le système de co-culture a entraîné un meilleur développement de la corticogenèse, (a) immunocoloration pour le marqueur de couche inférieure CTIP2 et le marqueur de couche supérieure SATB2 dans les hCOM par rapport aux hCO après 6 semaines et 10 semaines. ( b ) Épaisseur relative de la plaque corticale (CP) à la semaine 6 et à la semaine 10 dans les hCO et les hCOM. Pour chaque structure corticale, trois mesures ont été prises à des angles de 45° pour obtenir la valeur moyenne. L'épaisseur relative de CP est le rapport de l'épaisseur de CP à l'épaisseur totale de la surface ventriculaire à la surface piale. L'épaisseur de CP a été augmentée de manière statistiquement significative après 10 semaines dans les hCOM par rapport aux hCO, p < 0,05. Barres d'erreur ± SD, toutes les barres d'échelle : 100 µm, (c) les organoïdes corticaux immuno-colorés pour PAX6 et le marqueur IPC TBR2 ont montré une zone SVZ relativement étendue dans les hCOM par rapport aux hCO, et (d) la quantification statistique de l'expression de TBR2 a montré une différence significative dans hCOMs vs hCOs en S6 (P < 0,005). ( e ) Les organoïdes corticaux immuno-colorés pour le marqueur de couche supérieure BRN2 ont montré une zone élargie et plus définie dans les hCOM par rapport aux hCO. ( f ) La quantification statistique de l'expression de BRN2 a montré une différence significative entre les hCOM et les hCO en W10 (n = 4 répétitions biologiques au total, n = 2 CC1, n = 1 PCDH19 et n = 1 CHD2, n = 12 nombre d'organoïdes ont été analysés ). Barres d'erreur ± SD. Barre d'échelle, 100 µm.

Nous avons effectué d'autres tests d'immunocoloration pour explorer d'autres marqueurs neuronaux pour d'autres couches. HOPX, un marqueur de la couche gliale radiale externe (oSVZ), était plus étendu dans les hCOM que dans les hCO (Fig. 5a). L'analyse des images a montré que cette augmentation était significative (Fig. 5b). Au jour 70, nous avons observé une zone élargie d'expression de REELIN au niveau de la zone marginale (MZ) dans les hCOM par rapport aux hCO. REELIN est présent dans la MZ corticale et est sécrété par les neurones de Cajal-Retzius. REELIN est le composant clé de l'évolution de l'organisation radiale de la plaque corticale36 et il a été démontré que la perturbation de l'expression de REELIN affecte la bonne organisation laminaire du néocortex37. Au jour 70, nous avons observé que l'épaisseur de la couche exprimant REELIN était remarquablement améliorée dans les hCOM par rapport aux hCO (Fig. 5c). Pour caractériser cette expansion, nous avons mesuré l'épaisseur de la couche de Reelin dans les hCO et les hOM et les données ont démontré une amélioration presque double de la zone marginale dans le système de co-culture (Fig. 5d). Les chiffres représentatifs agrandis sont illustrés dans la Fig S3 supplémentaire.

Organisation et expression des marqueurs de différentes zones progénitrices, (a, b) Exemples d'images d'immunomarquage des marqueurs rGC HOPX après 10 semaines dans les hCOM et les hCO et la quantification de l'épaisseur relative de la zone oSVZ à la semaine 10 illustre une augmentation significative des hCOM par rapport aux hCO (p < 0005) (n > 10 structures corticales de 4 expériences indépendantes). Barres d'erreur ± SD, toutes les barres d'échelle : 100 µm, (c, d) images d'immunomarquage représentatives pour le marqueur de préplaque Cajal-Retzius REELIN après 10 semaines dans les hCOM et hCO et quantification de l'épaisseur relative de la zone MZ à la semaine 10. Pour chaque structure corticale, trois mesures ont été prises à des angles de 45° pour obtenir la moyenne. L'épaisseur de MZ a été augmentée de manière statistiquement significative après 10 semaines dans les hCOM par rapport aux hCO (p <0,0005) (n = 4 répétitions biologiques au total, n = 2 CC1, n = 1 PCDH19 et n = 1 CHD2, n = 10 nombre d'organoïdes ont été analysé). Barres d'erreur ± SD, barres d'échelle : 100 µm.

Ensuite, nous avons étudié si les signaux de signalisation des cellules méningées peuvent affecter l'amélioration de la prolifération des NP humaines sur la formation corticale dans un système organoïde cérébral 3D. Les preuves génétiques humaines existantes suggèrent fortement que la signalisation du facteur de croissance, telle que le FGF, régule la formation corticale humaine. Dans l'étude actuelle, les organoïdes humains témoins et de co-culture contenaient des neuroépithéliums organisés de manière stéréotypée rappelant le cortex en développement précoce, où les NP Ki67 + proliféraient à la surface apicale de la zone ventriculaire. Par rapport aux témoins, les hCOM abritaient plus de cellules Ki67 + à la semaine 10 par rapport à la semaine 8 où, dans la condition témoin, elles diminuaient au fil du temps de la semaine 8 à la semaine 10 (Fig S7 supplémentaire). La prolifération accrue a été prolongée et la plus importante à la semaine 8 à 10 dans les hCOM, cependant, dans les hCO témoins, elle a diminué avec le temps. Le cortex en développement des humains et d'autres mammifères gyrencéphaliques abritent une VZ et une SVZ plus grandes, qui sont composées de beaucoup plus de cellules gliales radiales et de progéniteurs intermédiaires43. Par conséquent, la prolifération accrue d'IPC dans notre système de co-culture suggère un meilleur modèle in vitro de corticogenèse avec une capacité d'expansion améliorée qui récapitule mieux le cerveau cortical humain, cependant, sur la base des données de quantification, la différence d'expression de Ki67 + entre les hCO et les hCOM n'était pas significative.

Nous avons ensuite demandé comment notre système de co-culture affecte la différenciation des astrocytes. Les astrocytes comprennent le type de cellule le plus nombreux dans le cerveau des mammifères et il a été démontré qu'ils ont des rôles importants dans le SNC tels que le recyclage des neurotransmetteurs44, le contrôle de la formation des synapses45 et la fonction46. Des études ont également montré que les méninges sont les sources importantes de facteurs inducteurs d'astrocytes dans le cerveau en développement. Nos résultats d'immunocoloration ont illustré l'expression des astrocytes au jour 56 et au jour 70 dans les hCO et les hCOM qui était dans une certaine mesure plus élevée dans les hCOM. (Fig. S8 supplémentaire).

La capacité des hiPSC à générer des constructions cérébrales 3D nous permet de développer une nouvelle plateforme de modélisation neurologique personnalisée et d'étudier les mécanismes sous-jacents au développement et à la maladie du cerveau humain. Malgré les technologies de pointe actuelles dans le développement des organoïdes cérébraux, de nombreux défis techniques subsistent. Dans cette étude, nous avons établi une méthode efficace basée sur la formation d'une seule rosette à partir d'iPSC pouvant atteindre environ 250 µm après 5 jours. En seulement cinq jours, ces structures en rosette ont montré une cytoarchitecture en forme de tube dans la région apicale exprimant PKC-Z et N-CADHERIN et les marqueurs progéniteurs neuronaux PAX6 et NESTIN dans la région basale. Nos résultats ont montré que ces organoïdes expriment des marqueurs du cerveau antérieur et des neurones après 21 jours. En outre, notre analyse d'immunomarquage dans différents cours du temps pourrait récapituler efficacement l'organisation histologique et le modèle d'expression des principaux marqueurs de développement dans le cortex humain en développement.

Il est important de noter que la plupart des méthodes expérimentales de la littérature commencent la fabrication d'organoïdes en générant plusieurs rosettes dès le début où chacune agit comme un centre de morphogenèse indépendant4,5,47. La création de rosettes simples a récemment suscité une plus grande attention48,49. Les protocoles à base de rosette unique impliquent l'isolement manuel et la culture de rosettes neurales bien formées, qui sont induites à l'aide de facteurs de croissance et d'autres molécules de signalisation. Cette approche permet une formation d'organoïdes plus cohérente et reproductible, résultant en des organoïdes plus homogènes et définis qui imitent mieux les aspects du développement précoce du cerveau. Cependant, cette approche est plus laborieuse et moins évolutive. En revanche, d'autres techniques telles que les protocoles basés sur le corps embryoïde impliquent de permettre aux cellules souches pluripotentes de s'agréger en structures tridimensionnelles sans manipulation manuelle. Cette approche est plus simple et demande moins de main-d'œuvre, permettant la génération d'un grand nombre d'organoïdes pour des études à haut débit, mais résultant en des organoïdes plus variables.50,51. Ici, nous montrons que notre méthode de formation d'organoïdes peut former des rosettes simples avec moins de variabilité de taille au cours d'expériences répétées et augmenter la cohérence de la morphologie et du phénotype des organoïdes du cerveau antérieur de 250 ± 20 µm. Cependant, il est important de noter que bien que notre méthode soit basée sur la formation d'une seule rosette au premier stade de la différenciation, la dissection des organoïdes au jour 42 a illustré plusieurs VZ qui montrent qu'à mesure que les hCO mûrissent, davantage de VZ peuvent être observées (Fig. 9).

Nous avons développé notre méthode avec un système de co-culture 3D utilisant des cellules méningées et des hCOM dérivés d'iPSC assemblés pour évaluer l'effet de la co-culture avec des cellules méningées sur la morphologie et le phénotype des organoïdes cérébraux corticaux. De nombreuses études ont montré le rôle crucial des méninges comme source de plusieurs facteurs trophiques dont le FGF215, le facteur de croissance analogue à l'insuline17,52, le CXCR1219 et l'acide rétinoïque22,23. Considérant que des études antérieures ont clairement montré le rôle crucial des méninges dans le développement des neurones, la production de progéniteurs intermédiaires et l'allongement du neuroépithélium22, nous avons voulu tirer parti des cellules méningées dans notre culture organoïde pour déterminer si nous pouvons améliorer la corticogenèse et la formation de la structure cérébrale. En fait, nous avons observé que la présence de cellules méningées, et peut-être de facteurs de signalisation de ces cellules, a considérablement amélioré la différenciation et la maturation des rosettes simples et amélioré la morphologie et le phénotype cortical de nos organoïdes du cerveau antérieur. Des études in vivo ont montré que les méninges sécrètent du SDF1 qui guide la migration tangentielle des cellules de Cajal-Retzius et des interneurones corticaux le long de la zone marginale corticale, assurant leur distribution correcte au cours de la corticogenèse42,53. Dans notre système de co-culture in vitro, nous avons observé des zones marginales significativement plus grandes et clairement définies montrées par une expression accrue de REELIN, ce qui suggère que la sécrétion de facteurs à partir de cellules méningées a généré une zone marginale mieux définie et donc une corticogenèse améliorée. Nous avons également observé des zones étendues d'IPC TBR2, du marqueur de couche profonde CITIP2 et du marqueur de couche supérieure BRN2. De plus, la couche oSVZ qui est la principale caractéristique d'un organoïde cortical humain et le sépare des rongeurs a été beaucoup plus étendue et bien définie dans notre système de co-culture. De plus, nous avons observé une maturation plus précoce des astrocytes dans notre système, ce qui est cohérent avec les études précédentes qui ont montré que les méninges sont des sources importantes de facteurs induisant les astrocytes dans le cerveau en développement54. Il est important de mentionner que, lors de la génération d'organoïdes entre les jours 9 et 11, les organoïdes ont été exposés à 1 % de FBS. Des études ont montré que le FBS peut réactiver et augmenter l'expression de GFAP55. Cependant, compte tenu du fait que les premiers astrocytes se différencieront vers le jour 40, soit environ 15 changements complets de médias après exposition à 1 % de FBS, cela pourrait suggérer que les astrocytes matures observés au jour 70 étaient moins susceptibles d'être générés en raison de l'effet moyen. Cependant, d'autres expériences ont dû déterminer si une expression accrue de GFAP a été observée en raison de la présence du FBS dans le milieu ou s'est exprimée en raison d'une différenciation et d'une maturation accrues. En outre, il serait plus informatif pour les études futures d'utiliser d'autres marqueurs d'astrocytes tels que la glutamine synthétase, le BLBP (protéine de liaison aux lipides du cerveau), le S100β, la vimentine et le CD49f. En outre, idéalement, il est recommandé de dériver des cellules méningées des mêmes lignées de cellules souches pluripotentes (PSC) utilisées pour générer des organoïdes corticaux afin de maintenir la compatibilité génétique et épigénétique nécessaire à la différenciation et au développement appropriés. Cependant, notre laboratoire de recherche ne s'est pas concentré sur la différenciation des cellules méningées des CSPi, et cela n'a pas été pris en compte dans notre étude. Il est également important de considérer les effets potentiels à long terme de la co-culture méningée sur le développement de hCO qui pourraient inclure des altérations de l'expression génique, de la prolifération cellulaire et de la différenciation. Ces effets peuvent influencer le développement et la maturation des hCOs et leur capacité à modéliser avec précision les troubles neurologiques. Cependant, des recherches supplémentaires sont nécessaires pour déterminer les effets spécifiques à long terme de la co-culture méningée sur le développement de hCO. L'analyse des propriétés fonctionnelles des hCO encapsulés dans les méninges, y compris leur capacité à générer une activité électrique et à répondre à des stimuli externes, pourrait fournir des informations précieuses pour comprendre leur potentiel en tant que modèles pour l'étude des troubles neurologiques et la découverte de médicaments. Les enregistrements électrophysiologiques et l'imagerie calcique sont des méthodes potentielles pour la caractérisation fonctionnelle des hCOs. Ces approches seront considérées dans nos futures études.

Notre système de co-culture a remarquablement amélioré l'architecture laminaire des organoïdes de la rosette et a permis de meilleures comparaisons des organoïdes avec les tissus humains natifs. Les cellules méningées jouent un rôle crucial dans le développement du cerveau in vivo, y compris dans la formation et la maturation du néocortex. Dans le cas des hCOM, l'inclusion de cellules méningées dans le système de co-culture 3D peut créer un environnement plus physiologiquement pertinent qui récapitule mieux la condition in vivo. Les cellules méningées sécrètent des facteurs de croissance et des cytokines qui régulent le développement neuronal, la prolifération cellulaire et la différenciation, ce qui peut favoriser le développement de certains sous-types neuronaux et leurs niveaux d'expression dans les hCOMs50,56. Cela peut expliquer pourquoi les hCOM ont montré des niveaux d'expression plus élevés de certains marqueurs de sous-types neuronaux par rapport aux hCO. Cependant, d'autres études sont nécessaires pour bien comprendre le rôle des cellules méningées dans le développement des organoïdes corticaux. Des études récentes ont montré que la signalisation mTOR peut réguler l'architecture du cortex humain en développement en maintenant l'organisation cytosquelettique des cellules oRG et l'échafaudage glial radial53. Ainsi, notre système de co-culture ayant une couche mieux définie et améliorée d'oRG offre un meilleur modèle in vitro pour récapituler l'état in vivo et une cytoarchitecture et une stratification améliorées du cerveau en développement.

De plus, de futures études pourraient envisager d'ajouter un type de cellule supplémentaire, comme les cellules endothéliales, en combinaison avec des cellules méningées pour permettre la vascularisation des organoïdes cérébraux. En ingénierie tissulaire, la génération d'organoïdes vascularisés est cruciale pour leur croissance soutenue et pour imiter le microenvironnement complexe in vivo. Les organoïdes dérivés de cellules souches pluripotentes manquent de vascularisation, et les stratégies actuelles de vascularisation des organoïdes ne reproduisent pas entièrement le co-développement in vivo. Pour relever ce défi, les chercheurs ont développé une puce microfluidique imprimée en 3D pour co-culturer des organoïdes dérivés de cellules souches pluripotentes humaines avec des cellules vasculaires d'une manière spatialement déterminée. Les péricytes et les cellules endothéliales sur puce se sont auto-assemblés en réseaux vasculaires organisés et intégrés aux organoïdes cérébraux, formant un organoïde neurovasculaire intégré57,58. De plus, les canaux microfluidiques fabriqués à partir de matériaux dégradables pourraient encore améliorer l'angiogenèse organoïde et mieux imiter le microenvironnement in vivo59. Cela fournira une meilleure plate-forme pour modéliser une variété de troubles neurologiques, en particulier les troubles du développement neurologique qui impliquent des anomalies du développement cortical, tels que les troubles du spectre autistique (TSA), le trouble déficitaire de l'attention avec hyperactivité (TDAH), la déficience intellectuelle (DI), le retard de développement, la schizophrénie et l'épilepsie, et d'autres applications thérapeutiques futures. En récapitulant les interactions cellulaires complexes qui se produisent au cours du développement cortical, ces modèles pourraient fournir de nouvelles informations sur les mécanismes sous-jacents de ces troubles et pourraient aider au développement de nouvelles stratégies thérapeutiques.

Toutes les données pertinentes sont incluses dans le manuscrit. Les matériaux, les données et les protocoles décrits dans le document sont disponibles sur demande raisonnable auprès de l'auteur correspondant.

Lancaster, MA et al. Les organoïdes cérébraux modélisent le développement du cerveau humain et la microcéphalie. Nature 501(7467), 373–379 (2013).

Article ADS CAS PubMed Google Scholar

Pasca, AM et al. Neurones corticaux fonctionnels et astrocytes de cellules souches pluripotentes humaines en culture 3D. Nat. Méthodes 12(7), 671–678 (2015).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Pașca, SP L'essor des cultures tridimensionnelles du cerveau humain. Nature 553(7689), 437–445 (2018).

Article ADS PubMed Google Scholar

Qian, X. et al. Organoïdes spécifiques à la région du cerveau utilisant des mini-bioréacteurs pour modéliser l'exposition au ZIKV. Cellule 165(5), 1238-1254 (2016).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Watanabe, M. et al. Des organoïdes cérébraux auto-organisés avec des caractéristiques spécifiques à l'homme prédisent des médicaments efficaces pour lutter contre l'infection par le virus Zika. Cell Rep. 21(2), 517–532 (2017).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Yin, X. et al. Ingénierie des organoïdes de cellules souches. Cellule souche cellulaire 18(1), 25–38 (2016).

Article MathSciNet CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Brassard, JA & Lutolf, MP Ingénierie de l'auto-organisation des cellules souches pour construire de meilleurs organoïdes. Cellule souche cellulaire 24(6), 860–876 (2019).

Article CAS PubMed Google Scholar

Jalink, P. & Caiazzo, M. Organoïdes cérébraux : Répondre au besoin d'un modèle humain de trouble neurologique. Biologie (Bâle) 10(8), 740 (2021).

CAS PubMed Google Scholar

Hartmann, D., Ziegenhagen, MW & Sievers, J. Les cellules méningées stimulent la migration neuronale et la formation de faisceaux gliaux radiaux à partir de la couche granulaire externe cérébelleuse. Neurosci. Lett. 244(3), 129–132 (1998).

Article CAS PubMed Google Scholar

Sievers, J. et al. Les cellules méningées organisent la glie superficielle limitante du cervelet et produisent des composants à la fois de la matrice interstitielle et de la membrane basale. J. Neurocytol. 23(2), 135–149 (1994).

Article CAS PubMed Google Scholar

Krisch, B., Leonhardt, H. & Oksche, A. Compartiments et disposition périvasculaire des méninges recouvrant le cortex cérébral du rat. Tissu cellulaire Res. 238(3), 459–474 (1984).

Article CAS PubMed Google Scholar

Halfter, W. et al. Une fonction critique de la membrane basale piale dans l'histogenèse corticale. J. Neurosci. 22(14), 6029–6040 (2002).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Nakagomi, T. & Matsuyama, T. Leptomeninges : Une nouvelle niche de cellules souches à potentiel neurogène. Recherche sur les cellules souches. 4, 22 (2017).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Decimo, I. et al. Méninges : De la membrane protectrice à la niche des cellules souches. Suis. J. Cellules souches 1(2), 92–105 (2012).

CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Mercier, F. & Hatton, GI La connexine 26 et le facteur de croissance basique des fibroblastes sont exprimés principalement dans les couches sous-piales et sous-épendymaires du parenchyme cérébral adulte : rôles dans la prolifération des cellules souches et la plasticité morphologique ?. J. Comp. Neurol. 431(1), 88–104 (2001).

3.0.CO;2-D" data-track-action="article reference" href="https://doi.org/10.1002%2F1096-9861%2820010226%29431%3A1%3C88%3A%3AAID-CNE1057%3E3.0.CO%3B2-D" aria-label="Article reference 15" data-doi="10.1002/1096-9861(20010226)431:13.0.CO;2-D">Article CAS PubMed Google Scholar

Stylianopoulou, F. et al. Expression du gène du facteur de croissance II analogue à l'insuline dans le plexus choroïde et les leptoméninges du système nerveux central du rat adulte. Proc. Natl. Acad. Sci. 85(1), 141-145 (1988).

Article ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Brar, A. & Chernausek, S. Localisation de l'expression de la protéine de liaison au facteur de croissance analogue à l'insuline-4 dans le cerveau de rat en développement et adulte : analyse par hybridation in situ. J. Neurosci. Rés. 35(1), 103–114 (1993).

Article CAS PubMed Google Scholar

Stumm, R. et al. Modèles d'ARNm de SDF-1α et SDF-1γ, voies de migration et phénotypes de neurones exprimant CXCR4 dans le télencéphale de rat en développement. J. Comp. Neurol. 502(3), 382–399 (2007).

Article CAS PubMed Google Scholar

Reiss, K. et al. Le facteur 1 dérivé des cellules stromales est sécrété par les cellules méningées et agit comme facteur chimiotactique sur les cellules souches neuronales de la couche granuleuse externe du cervelet. Neurosciences 115(1), 295–305 (2002).

Article CAS PubMed Google Scholar

Berger, O. et al. Expression de SDF-1 et CXCR4 lors de la réorganisation du gyrus denté postnatal. Dév. Neurosci. 29(1–2), 48–58 (2007).

Article CAS PubMed Google Scholar

Borrell, V. & Marín, O. Meninges contrôlent la migration tangentielle des cellules Cajal-Retzius dérivées de l'ourlet via la signalisation CXCL12/CXCR4. Nat. Neurosci. 9(10), 1284–1293 (2006).

Article CAS PubMed Google Scholar

Siegenthaler, JA et al. L'acide rétinoïque des méninges régule la génération de neurones corticaux. Cellule 139(3), 597–609 (2009).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zhang, J. et al. Les méninges sont une source d'acide rétinoïque pour le cerveau postérieur à développement tardif. J. Neurosci. 23(20), 7610–7620 (2003).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Choe, Y., Siegenthaler, JA & Pleasure, SJ Une cascade de signalisation morphogénique initiée par les méninges contrôle la formation du corps calleux. Neurone 73(4), 698–712 (2012).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Hebert, JM, Mishina, Y. & McConnell, SK La signalisation BMP est requise localement pour modeler la ligne médiane télencéphalique dorsale. Neurone 35(6), 1029–1041 (2002).

Article CAS PubMed Google Scholar

Lehtinen, MK et al. Le liquide céphalo-rachidien fournit une niche proliférative pour les cellules progénitrices neurales. Neurone 69(5), 893–905 (2011).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Haubst, N. et al. Dissection moléculaire de la fonction Pax6 : les rôles spécifiques du domaine apparié et de l'homéodomaine dans le développement du cerveau. Développement 131(24), 6131–6140 (2004).

Article CAS PubMed Google Scholar

Eiraku, M. et al. Morphogenèse auto-organisatrice de la cupule optique en culture tridimensionnelle. Nature 472(7341), 51–56 (2011).

Article ADS CAS PubMed Google Scholar

Decimo, I. et al. Méninges : Une niche répandue de progéniteurs neuronaux pour le cerveau. Neuroscientifique 27(5), 506–528 (2021).

Article PubMed Google Scholar

Lancaster, MA et al. Auto-organisation guidée et formation de plaques corticales dans les organoïdes du cerveau humain. Nat. Biotechnol. 35(7), 659–666 (2017).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Holloway, EM, Capeling, MM & Spence, JR Approches inspirées de la biologie pour améliorer la complexité des organoïdes humains. Développement 146(8), 166173 (2019).

Article Google Scholar

Bagley, JA et al. Les organoïdes cérébraux fusionnés modélisent les interactions entre les régions du cerveau. Nat. Méthodes 14(7), 743–751 (2017).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Shi, Y. et al. Développement du cortex cérébral humain des cellules souches pluripotentes aux synapses excitatrices fonctionnelles. Nat. Neurosci. 15(3), 477-486S1 (2012).

Article CAS PubMed Google Scholar

Sessa, A. et al. Tbr2 dirige la conversion de la glie radiale en précurseurs basaux et guide l'amplification neuronale par neurogenèse indirecte dans le néocortex en développement. Neurone 60(1), 56–69 (2008).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Martinez-Cerdeno, V., Noctor, SC & Kriegstein, AR Le rôle des cellules progénitrices intermédiaires dans l'expansion évolutive du cortex cérébral. Cerb. Cortex 16 (Suppl 1), i152–i161 (2006).

Article PubMed Google Scholar

Englund, C. et al. Pax6, Tbr2 et Tbr1 sont exprimés séquentiellement par la glie radiale, les cellules progénitrices intermédiaires et les neurones postmitotiques dans le néocortex en développement. J. Neurosci. 25(1), 247–251 (2005).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Smart, IH et al. Caractéristiques morphologiques uniques des zones prolifératives et des compartiments postmitotiques de l'épithélium neural donnant naissance au cortex strié et extrastrié chez le singe. Cerb. Cortex 12(1), 37–53 (2002).

Article PubMed Google Scholar

Pollen, AA et al. Identité moléculaire de la glie radiale externe humaine au cours du développement cortical. Cellule 163(1), 55–67 (2015).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Lui, JH, Hansen, DV & Kriegstein, AR Développement et évolution du néocortex humain. Cellule 146(1), 18–36 (2011).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ito, Y. et al. L'inactivation conditionnelle de Tgfbr2 dans la crête neurale crânienne provoque une fente palatine et des défauts de calvaria. Développement 130(21), 5269–5280 (2003).

Article CAS PubMed Google Scholar

Mehrara, BJ et al. L'expression du facteur de croissance basique des fibroblastes et du facteur de croissance transformant bêta-1 dans la dure-mère en développement est en corrélation avec la formation d'os crânien. Plas. Reconstr. Surg. 104(2), 435–444 (1999).

Article CAS PubMed Google Scholar

Borrell, V. & Marin, O. Meninges contrôlent la migration tangentielle des cellules Cajal – Retzius dérivées de l'ourlet via la signalisation CXCL12/CXCR4. Nat. Neurosci. 9(10), 1284–1293 (2006).

Article CAS PubMed Google Scholar

Hansen, DV et al. Glie radiale neurogène dans la zone sous-ventriculaire externe du néocortex humain. Nature 464(7288), 554–561 (2010).

Article ADS CAS PubMed Google Scholar

Sloan, SA et al. Maturation des astrocytes humains capturée dans des sphéroïdes corticaux cérébraux 3D dérivés de cellules souches pluripotentes. Neurone 95(4), 779-790e6 (2017).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Allen, NJ et al. Les glypicans 4 et 6 des astrocytes favorisent la formation de synapses excitatrices via les récepteurs GluA1 AMPA. Nature 486(7403), 410–414 (2012).

Article ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Tsai, YJ et al. Effets du traitement hypothermique régional et du corps entier avant et après une lésion du nerf médian sur la douleur neuropathique et l'activation gliale dans le noyau cunéiforme du rat. Anesthésiologie 116(2), 415–431 (2012).

Article PubMed Google Scholar

Birey, F. et al. Assemblage de sphéroïdes de cerveau antérieur humain fonctionnellement intégrés. Nature 545(7652), 54–59 (2017).

Article ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Chevalier, GT et al. Induction d'ingénierie de l'émergence de rosettes neurales singulières dans les tissus dérivés de hPSC. Elife 7, e37549 (2018).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Tidball, AM et al. Organoïdes cérébraux auto-organisés à rosette unique à partir de cellules souches pluripotentes humaines. bioRxiv 2022.02.28.482350 (2022).

Lancaster, MA & Knoblich, JA Génération d'organoïdes cérébraux à partir de cellules souches pluripotentes humaines. Nat. Protocole 9(10), 2329-2340 (2014).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Boisvert, EM et al. Une méthode statique auto-dirigée pour générer des organoïdes cérébraux à partir de cellules souches embryonnaires humaines. J.Vis. Exp. 4(157), 60379 (2020).

Google Scholar

Article ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Paredes, MF et al. Le facteur 1 dérivé du stroma (CXCL12) régule la position laminaire des cellules de Cajal-Retzius dans les cerveaux normaux et dysplasiques. J. Neurosci. 26(37), 9404–9412 (2006).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kawamura, Y. et al. Induction synergique de la différenciation astrocytaire par des facteurs sécrétés par les méninges dans le cerveau en développement de la souris. FEBS Lett. 591(22), 3709–3720 (2017).

Article CAS PubMed Google Scholar

Herrera, F., Chen, Q. & Schubert, D. Effet synergique de l'acide rétinoïque et des cytokines sur la régulation de l'expression des protéines acides fibrillaires gliales. J. Biol. Chim. 285(50), 38915–38922 (2010).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Wang, H. Modélisation des maladies neurologiques avec des organoïdes du cerveau humain. Devant. Synaptic Neurosci. 10, 15 (2018).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Saumon, I. et al. Ingénierie d'organoïdes neurovasculaires avec des puces microfluidiques imprimées en 3D. Puce de laboratoire 22(8), 1615–1629 (2022).

Article CAS PubMed Google Scholar

Shirure, VS, Hughes, CCW & George, SC Ingénierie de modèles organoïdes vascularisés sur puce. Annu. Rév. Biomed. Ing. 23, 141-167 (2021).

Article CAS PubMed Google Scholar

Hoang, P. & Ma, Z. Ingénierie organoïde de cellules souches guidée par biomatériaux pour modéliser le développement et les maladies. Acta Biomater. 132, 23–36 (2021).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

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Je tiens également à remercier le Département de neurologie de l'Université du Michigan pour avoir fourni les installations nécessaires à la mise en œuvre des expériences. Je tiens à remercier le Dr Kamran Avanaki du Département de génie biomédical de l'Université de l'Illinois à Chicago pour ses recommandations perspicaces dans la révision du manuscrit.

National Center for Advancing Translational Sciences, National Institutes of Health, sous Grant KL2TR002002.

Département de neurologie, University of Michigan Medical Center, Ann Arbor, MI, 48109, États-Unis

Elmira Galilian

Division of Engineering in Medicine, Department of Medicine, Harvard Medical School, Brigham and Women's Hospital, Cambridge, MA, 02139, États-Unis

Su Ryon Shin

Département d'ophtalmologie et des sciences visuelles, Université de l'Illinois à Chicago, Chicago, IL, 60612, États-Unis

Elmira Galilian

Richard and Loan Hill Department of Bioengineering, Université de l'Illinois à Chicago, Chicago, IL, 60607, États-Unis

Elmira Galilian

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EJ a conçu, supervisé, réalisé toute la partie des études et rédigé le manuscrit. SRS a fourni un soutien scientifique, a lu et a accepté la version publiée du manuscrit.

Correspondance à Elmira Jalilian.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

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Réimpressions et autorisations

Jalilian, E., Shin, SR Un nouveau modèle de système de co-culture organoïde corticale-méningée améliore la cytoarchitecture organoïde du cerveau cortical humain. Sci Rep 13, 7809 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-35077-9

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Reçu : 23 janvier 2023

Accepté : 12 mai 2023

Publié: 14 mai 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s41598-023-35077-9

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