Limosilactobacillus muqueuses

npj Biofilms et Microbiomes volume 9, Numéro d'article : 33 (2023) Citer cet article

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La maladie diarrhéique entraîne une mortalité élevée, en particulier chez les enfants et les jeunes animaux. Le microbiote intestinal est fortement associé aux maladies diarrhéiques, et certaines souches spécifiques de bactéries ont démontré des effets antidiarrhéiques. Cependant, les mécanismes antidiarrhéiques des souches probiotiques n'ont pas été élucidés. Ici, nous avons utilisé des porcelets nouveau-nés comme modèle translationnel et avons constaté que la dysbiose du microbiote intestinal observée chez les porcelets diarrhéiques était principalement caractérisée par une déficience en Lactobacillus, une abondance d'Escherichia coli et une biosynthèse enrichie en lipopolysaccharides. Limosilactobacillus mucosae et Limosilactobacillus reuteri étaient une bactérie caractéristique qui différenciait les porcelets sains des porcelets diarrhéiques. Des souris sans germe (GF) transplantées avec le microbiote fécal de porcelets diarrhéiques ont reproduit les symptômes de la maladie diarrhéique. L'administration de Limosilactobacillus mucosae mais pas de Limosilactobacillus reuteri a atténué les symptômes de la maladie diarrhéique induits par le microbiote fécal des porcelets diarrhéiques et par la provocation à ETEC K88. Notamment, les vésicules extracellulaires dérivées de Limosilactobacillus mucosae atténuent les symptômes de la maladie diarrhéique causés par ETEC K88 en régulant les phénotypes des macrophages. Des expériences d'élimination des macrophages ont démontré que les vésicules extracellulaires atténuaient les symptômes de la maladie diarrhéique d'une manière dépendante des macrophages. Nos résultats donnent un aperçu de la pathogenèse des maladies diarrhéiques du point de vue du microbiote intestinal et du développement de stratégies thérapeutiques antidiarrhéiques à base de probiotiques.

Les maladies diarrhéiques sont courantes chez les nourrissons, avec plus de 500 000 décès dus à des maladies diarrhéiques signalés chaque année dans le monde chez les enfants de moins de 5 ans1,2,3. Outre leur mortalité élevée, les maladies diarrhéiques de la petite enfance entraînent une malnutrition et des lésions intestinales persistantes4,5,6. La maladie diarrhéique entraîne une altération de la fonction de barrière intestinale et une augmentation de la perméabilité de la muqueuse intestinale, induisant l'apparition d'une inflammation intestinale et, finalement, un retard de croissance, ainsi qu'une résistance réduite aux infections pathogènes ultérieures7,8. Bien que les mécanismes conduisant à la diarrhée aient été étudiés pendant des décennies et que la mortalité par diarrhée ait considérablement diminué, la diarrhée continue d'entraîner une mortalité et une morbidité humaines importantes, principalement en raison de ses causes complexes9,10. Par conséquent, élucider la pathogenèse des maladies diarrhéiques néonatales est d'une grande importance.

La petite enfance est une fenêtre d'opportunité pour le développement du microbiote intestinal, de la fonction de barrière physique intestinale et du système immunitaire11. Le microbiote intestinal du nouveau-né a de profondes répercussions sur la santé de l'hôte en régulant le métabolisme des nutriments intestinaux, la maturation du système immunitaire et le maintien de la barrière intestinale12,13,14,15. L'instabilité du microbiote intestinal et l'immaturité du système immunitaire rendent les nouveau-nés particulièrement vulnérables aux agents pathogènes16. Lors de diarrhées, une augmentation marquée de la colonisation de microorganismes pathogènes suit la perturbation de la composition du microbiote intestinal, suggérant que les perturbations du microbiote renforcent la pathogénicité de ces souches17. Un microbiote intestinal stable favorise la santé de l'hôte en améliorant la résistance à la colonisation par des micro-organismes pathogènes18,19.

Récemment, la transplantation de microbiote fécal (FMT) a obtenu des résultats positifs inattendus dans le traitement de l'infection à Clostridium difficile, des maladies inflammatoires de l'intestin et du syndrome du côlon irritable ; par conséquent, la FMT est devenue une thérapie de routine pour les maladies intestinales complexes20,21,22,23. Cependant, il a été difficile de clarifier quels micro-organismes intestinaux confèrent l'effet thérapeutique pendant le traitement FMT. De plus en plus de preuves suggèrent que la reconstitution du microbiote intestinal avec des souches probiotiques clés est une stratégie efficace contre les maladies gastro-intestinales24,25. Ainsi, l'identification de probiotiques spécifiques potentiels ayant un potentiel de soulagement de la diarrhée peut fournir de nouvelles stratégies pour le contrôle précis des maladies diarrhéiques néonatales et la prévention des maladies intestinales.

Les vésicules extracellulaires bactériennes (VE) participent à une grande variété de fonctions physiopathologiques qui impliquent des interactions intercellulaires, telles que l'acquisition de nutriments, l'apport de facteurs de virulence et la régulation immunitaire26,27. En particulier, il a été démontré que les véhicules électriques interviennent dans la pathogenèse et l'invasion bactériennes par l'apport de toxines et de facteurs de virulence aux cellules hôtes28. Une grande partie des premiers travaux sur les VE bactériennes se sont concentrés sur leurs rôles dans les bactéries Gram-négatives pathogènes, mais il a récemment été démontré qu'un nombre croissant de bactéries Gram-positives produisent des VE. Par exemple, les bactéries Gram-positives productrices d'EV comprennent Bacillus anthracis29, Streptococcus pneumoniae30, B. subtilis31 et C. perfringens32. Lactobacillus est la bactérie Gram-positive la plus courante, et plusieurs espèces de Lactobacillus se sont récemment avérées produire des véhicules électriques, telles que L. casei BL2333, L. plantarum WCFS134 et L. acidophilus35. Cependant, les rôles et fonctions potentiels de ces véhicules électriques dérivés de Lactobacillus n'ont pas été largement étudiés, même si une étude récente a montré que certaines souches de Lactobacillus ont une efficacité supérieure dans la prévention des maladies diarrhéiques chez les mammifères24. Par conséquent, la question de savoir si les Lactobacillus aux propriétés antidiarrhéiques exercent leurs effets via leurs véhicules électriques mérite une exploration plus approfondie.

Les similitudes dans la structure intestinale et le développement entre les humains et les porcs font des porcs un modèle animal supérieur pour étudier la base physiopathologique des maladies gastro-intestinales36,37. Ici, en utilisant des porcelets néonatals, des souris sans germes (GF) et des souris exemptes d'agents pathogènes spécifiés (SPF) comme modèles animaux et en intégrant la multi-omique, la transplantation microbienne fécale (FMT), induite par Escherichia coli entérotoxinogène (ETEC K88) dommages inflammatoires intestinaux et des interventions avec Limosilactobacillus mucosae (L. mucosae) et ses véhicules électriques dérivés, cette étude a caractérisé systématiquement le microbiome intestinal des porcelets nouveau-nés atteints de diarrhée, a révélé en outre la relation causale entre le microbiote intestinal et les symptômes de la maladie diarrhéique et a élucidé le mécanisme sous-jacent en lequel Lactobacillus dérivé de porcelets sains réduit les symptômes des maladies diarrhéiques. Ces résultats donnent un aperçu de la façon dont les lactobacilles et ses EV dérivés affectent la santé intestinale du nourrisson et suggèrent des stratégies pour la prévention et le traitement des maladies liées à la diarrhée.

Pour révéler les caractéristiques de la composition et de la fonction du microbiote intestinal chez les porcelets nouveau-nés sains et diarrhéiques, nous avons effectué un séquençage métagénomique d'échantillons fécaux prélevés sur 30 porcelets nouveau-nés sains et 30 porcelets nouveau-nés diarrhéiques (Fig. 1A). Au niveau du phylum, l'indice de richesse était significativement plus faible (P = 0,035) tandis que les indices de Shannon (P = 0,043) et de Simpson (P = 0,022) étaient significativement plus élevés chez les porcelets diarrhéiques par rapport aux porcelets sains (Fig. 1A supplémentaire). Une analyse des coordonnées principales (PCoA) a montré que la structure microbienne différait également entre les deux groupes (P = 0, 002; Fig. 1B supplémentaire). Firmicutes, Bacteroidetes et Proteobacteria étaient le phylum dominant dans les deux groupes (Fig. 1C supplémentaire). Les proportions de Firmicutes et d'Actinobactéries étaient significativement plus faibles chez les porcelets diarrhéiques, tandis que la proportion de Fusobactéries était significativement plus élevée (Fig. 1D supplémentaire).

Une sélection de porcelets nouveau-nés et diarrhéiques en bonne santé. B Transplantation de microbiote fécal de porcelets sains et diarrhéiques à des souris GF. C L'effet protecteur de L. mucosae et L. reuteri sur les dommages intestinaux causés par le microbiote fécal chez les porcelets diarrhéiques. D L'effet protecteur de L. mucosae sur les dommages intestinaux causés par ETEC K88. E L'effet protecteur des VE de L. mucosae sur les dommages intestinaux causés par ETEC K88. F Élimination in vivo des macrophages chez la souris.

Au niveau du genre, l'indice de richesse était significativement plus faible (P = 0,000) et l'indice de Simpson (P = 0,018) était significativement plus élevé chez les porcelets nouveau-nés diarrhéiques (Fig. 2A supplémentaire). Il y avait également des différences significatives dans la structure du microbiote au niveau des genres entre les deux groupes (P = 0, 000; Fig. 2B supplémentaire). Lactobacillus, Escherichia et Bacteroides étaient les genres dominants chez les porcelets nouveau-nés diarrhéiques, tandis que Lactobacillus, Bacteroides et Prevotella étaient les genres dominants chez les porcelets nouveau-nés en bonne santé (Fig. 2C supplémentaire). Nous avons identifié 21 genres bactériens différentiels entre les porcelets nouveau-nés sains et diarrhéiques (Fig. 2D supplémentaire). Comparativement aux porcelets nouveau-nés sains, les porcelets nouveau-nés diarrhéiques ont été caractérisés par cinq genres enrichis (Vagococcus, Sutterella, Megasphaera, Fusobacterium et Allisonella) et par 16 genres appauvris (Streptococcus, Slackia, Ruthenibacterium, Peptostreptococcus, Lactobacillus, Holdemanella, Gemella, Faecalicoccus, Erysipelatoclostridium , Eisenbergiella, Collinsella, Clostridium, Christensenella, Campylobacter, Anaerotruncus et Anaeromassilibacillus).

Au niveau de l'espèce, l'indice de richesse était significativement plus faible (P = 0,001) chez les porcelets diarrhéiques que chez les porcelets sains (Fig. 2A). Nous avons trouvé des différences significatives dans la structure microbienne à ce niveau entre les deux groupes par analyse PCoA (P = 0,001 ; Fig. 2B). Nous avons observé que l'abondance relative d'E. coli était la plus élevée chez les porcelets souffrant de diarrhée et que L. vaginalis était la plus élevée chez les porcelets en bonne santé (Fig. 2C). De plus, nous avons constaté que les abondances relatives d'un total de 31 espèces étaient significativement différentes entre les deux groupes (Fig. 2D). Des analyses forestières aléatoires ont montré que plusieurs espèces clés, notamment Ruthenibacterium lactiformans, Limosilactobacillus reuteri (L. reuteri) et L. mucosae, peuvent jouer un rôle important dans la médiation de l'apparition de la diarrhée (Fig. 2E). La précision du modèle de classification forestière aléatoire établi à l'aide de ces 20 bactéries comme variables a été testée par des analyses de la courbe caractéristique de fonctionnement du récepteur (ROC), et la valeur AUC a atteint 0, 967, indiquant la grande précision de notre modèle (Fig. 2F).

Une comparaison de la diversité alpha (richesse, Shannon et Simpson) des microbiomes intestinaux au niveau de l'espèce entre les porcelets nouveau-nés sains et diarrhéiques. B Analyse PCoA des microbiomes intestinaux entre porcelets nouveau-nés sains et diarrhéiques au niveau de l'espèce ; les données ont été analysées à l'aide de PERMANOVA. C Histogramme de la composition spécifique des 20 principales espèces bactériennes. D Espèces bactériennes différentielles entre les deux groupes. E Espèces clés obtenues à partir d'analyses forestières aléatoires. L'analyse F ROC a été effectuée pour le modèle de forêt aléatoire. G Les 20 meilleures voies KEGG enrichies par des KO différentiels. H Teneur en LPS fécal. n = 30. Les données ont été exprimées sous forme de moyennes ± SEM (H) et une ANOVA unidirectionnelle a été effectuée, suivie du test de LSD (H). *P < 0,05, groupe diarrhée vs groupe sain.

Au total, 410 orthologues (KO) de l'Encyclopédie des gènes et des génomes de Kyoto (KEGG) qui différaient significativement entre les deux groupes ont été identifiés (tableau supplémentaire 1). Une analyse de la fonction KEGG a en outre révélé que l'enrichissement des voies suivantes différait significativement entre les deux groupes : biosynthèse des cofacteurs, biosynthèse des acides aminés, métabolisme du carbone, métabolisme des sucres aminés et des sucres nucléotidiques, ribosome, phosphorylation oxydative, biosynthèse des sucres nucléotidiques de l'antigène O , métabolisme de la cystéine et de la méthionine, glycolyse/gluconéogenèse, métabolisme du pyruvate, assemblage flagellaire, cycle du citrate, biosynthèse des aminoacyl-ARNt, voie des pentoses phosphates, recombinaison homologue, réparation des mésappariements, biosynthèse des lipopolysaccharides, métabolisme de la thiamine, un pool de carbone par le folate et la cellule de Caulobacter cycle (Fig. 2G). Nous avons en outre observé que tous les KO enrichis dans la voie de biosynthèse des lipopolysaccharides (LPS) étaient élevés chez les porcelets nouveau-nés diarrhéiques (tableau supplémentaire 1). En conséquence, la teneur en LPS fécal était significativement plus élevée chez les porcelets diarrhéiques par rapport aux porcelets sains (P <0, 05; Fig. 2H).

Pour évaluer l'effet du microbiote intestinal des porcelets diarrhéiques sur la croissance de l'hôte et l'état inflammatoire, nous avons réalisé une expérience FMT (Fig. 1B). Nous avons constaté que le taux d'augmentation du poids corporel du groupe H-FMT était significativement plus élevé que celui du groupe D-FMT à partir du jour 5, et cette différence de taux a persisté jusqu'à la fin de l'expérience (Fig. 3A). Nous avons mesuré les paramètres biochimiques de routine dans le sang (Fig. 3B) ; nombre total de globules blancs (WBC) (P = 0,001), lymphocytes (LYM) (P = 0,049), granulocytes neutrophiles (NEU) (P = 0,041), monocytes (MON) (P = 0,000) et MON% (P = 0,039) étaient significativement plus élevés dans le groupe D-FMT.

A Poids corporels des souris pendant la période expérimentale. B Niveaux de WBC, LYM, NEU, MON, LYM%, NEU% et MON% dans le sang de souris expérimentales. C Parcelle volcanique des gènes différentiels dans cinq segments intestinaux. Le bleu désigne les gènes qui sont significativement régulés à la baisse dans le groupe D-FMT, et le rouge désigne les gènes qui sont considérablement régulés à la hausse dans le groupe D-FMT. Voies de signalisation D KEGG enrichies en cinq gènes différentiels de segment intestinal. Les tailles des cercles représentent le nombre de gènes enrichis dans la voie, et la couleur est liée à P_adjust. n = 10 pour A, B ; n = 4 pour C, D. Les données ont été exprimées sous forme de moyennes ± SEM (A, B) et une ANOVA à une voie a été effectuée, suivie du test de LSD (A, B). *P < 0,05 : groupe H-FMT vs groupe D-FMT.

Nous avons séquencé et analysé les transcriptomes des cellules hôtes du duodénum, ​​du jéjunum, de l'iléon, du caecum et du côlon des deux groupes de souris. Les profils génétiques dans ces cinq segments intestinaux présentaient des schémas distincts après FMT (Fig. 3C). Nous avons constaté qu'il y avait 134 gènes différentiels dans le duodénum, ​​dont 79 gènes étaient significativement régulés à la hausse et 55 gènes étaient significativement régulés à la baisse dans le groupe D-FMT. Il y avait 309 gènes différentiels dans le jéjunum, avec 176 gènes significativement régulés positivement et 133 gènes significativement régulés négativement dans le groupe D-FMT. Il y avait 1609 gènes différentiels dans l'iléon, avec 670 gènes significativement régulés positivement et 939 gènes significativement régulés négativement dans le groupe D-FMT. Il y avait 204 gènes différentiels dans le caecum, avec 95 gènes significativement régulés positivement et 109 gènes significativement régulés négativement dans le groupe D-FMT. Il y avait 812 gènes différentiels dans le côlon, avec 570 gènes significativement régulés positivement et 242 gènes significativement régulés négativement dans le groupe D-FMT.

Nous avons annoté les voies dans lesquelles ces gènes différentiels sont impliqués (Fig. 3D) et avons constaté que plusieurs voies de signalisation étaient significativement enrichies dans les cinq segments intestinaux, y compris la voie de signalisation NF-κB, la voie de signalisation de la phospholipase D, les molécules d'adhésion cellulaire, B voies de signalisation des récepteurs cellulaires, la voie de signalisation Fc epsilon RI, la voie de signalisation phosphoinositide 3-kinase/Akt et les voies de signalisation du calcium. De plus, nous avons montré que les principaux gènes différentiels impliqués dans les voies de signalisation ci-dessus étaient observés dans tous les segments intestinaux (Fig. 3 supplémentaire).

Nous avons constaté que la longueur des villosités de l'iléon chez les souris du groupe D-FMT était significativement raccourcie (P = 0,000) et que le rapport de longueur des villosités à la crypte dans le groupe D-FMT était significativement inférieur (P = 0,000) à celui de Groupe H-FMT (Fig. 4A et Fig. 4A supplémentaire). Le score histopathologique colique était significativement plus élevé dans le groupe D-FMT (P = 0,013 ; Fig. 4A et Fig. 4A supplémentaire), et le nombre de mucines neutres et de mucines acides était significativement plus faible dans le groupe D-FMT que dans le groupe H -Groupe FMT dans l'iléon (P = 0,013/0,009) et le côlon (P = 0,043/0,029) (Fig. 4A et Fig. 4A supplémentaire).

A Coupes de tissus iléon et côlon de souris H-FMT et D-FMT : la première rangée de l'image montre la coloration H&E, la deuxième rangée montre la coloration PAS et la troisième rangée montre la coloration AB (barre d'échelle, 50 μm). B Les niveaux d'IL-1β, IL-6, IL-8, TNF-α, LPS, DAO et D-LA dans le sérum. C Les niveaux d'IL-1β, IL-6, IL-8, TNF-α, LPS, DAO et D-LA dans le tissu iléal. D Les niveaux d'IL-1β, IL-6, IL-8, TNF-α, LPS, DAO et D-LA dans le tissu du côlon. E Niveaux des protéines ZO-1, occludine, AKT et NF-κB et p-AKT et p-NF-κB dans l'iléon et le côlon. F Analyse PCoA au niveau des espèces : les données ont été analysées à l'aide de PERMANOVA ; Histogramme de la composition des espèces des 20 principales espèces ; Les 20 meilleures voies KEGG enrichies en KO différentiels ; Graphiques à bulles microbiens des différences entre les groupes H-FMT et D-FMT au niveau de l'espèce. G Analyse PLS-DA du métabolome ; La carte thermique des métabolites différentiels. Le côté gauche de l'image est le groupe enrichi de métabolites, et le côté droit est le nom du métabolite et sa classe correspondante. n = 10 pour A–D, F, G ; n = 4 pour E. Les données ont été exprimées sous forme de moyennes ± SEM (B – D) et une ANOVA à une voie a été effectuée, suivie du test de LSD (B – D). *P < 0,05 : groupe H-FMT vs groupe D-FMT.

Nous avons également mesuré les indicateurs liés à l'inflammation et à la perméabilité intestinale dans le sérum, l'iléon et le côlon. Les taux sériques d'interleukine (IL)-1β (P = 0,001), IL-6 (P = 0,041), IL-8 (P = 0,017), facteur de nécrose tumorale (TNF)-α (P = 0,045), LPS ( P = 0,004), les concentrations de diamine peroxydase (DAO) (P = 0,019) et de d-lactate (d-LA) (P = 0,021) étaient significativement plus élevées dans le groupe D-FMT que dans le groupe H-FMT (Fig. 4B). Les niveaux d'IL-1β (P = 0,029), d'IL-6 (P = 0,013) et de TNF-α (P = 0,035) étaient significativement plus élevés dans l'ilée des souris du groupe D-FMT que dans le H-FMT groupe, mais il n'y avait pas de différence significative dans les niveaux de LPS, IL-8, DAO ou D-LA dans l'ilée des souris GF entre les deux groupes (Fig. 4C). Les niveaux d'IL-1β (P = 0,041), IL-6 (P = 0,005), IL-8 (P = 0,004), TNF-α (P = 0,039) et LPS (P = 0,037) dans le côlon étaient significativement plus élevé dans le groupe D-FMT que dans le groupe H-FMT, tandis que DAO et d-LA n'étaient pas significativement différents (Fig. 4D) entre les deux groupes. Comme le montre la figure 4E, les niveaux d'expression des protéines ZO-1 et occludine dans le groupe D-FMT ont été significativement diminués à la fois dans l'iléon et le côlon. De plus, l'abondance protéique de l'AKT total et du NF-κB était similaire entre les groupes D-FMT et H-FMT, mais les niveaux de p-AKT et de p-NF-κB dans le D-FMT étaient significativement plus élevés dans le groupe D-FMT. que ceux du groupe H-FMT.

Pour étudier la composition et la fonction du microbiome intestinal chez les souris GF après FMT, nous avons effectué des analyses de séquençage métagénomique sur des échantillons fécaux. Au niveau du phylum, il y avait une différence significative dans l'indice de richesse (P = 0, 003; Fig. 5A supplémentaire). Aucune différence de diversité bêta au niveau du phylum n'a été observée entre les deux groupes (Fig. 5B supplémentaire). Nous avons analysé la composition du phylum des deux groupes (Fig. 5C supplémentaire) et avons constaté que le microbiote des deux groupes était principalement composé de Bacteroidetes et de Firmicutes. Une analyse plus approfondie des différences entre les bactéries a montré qu'une abondance relative significativement plus faible d'actinobactéries a été observée dans le groupe D-FMT (Fig. 5D supplémentaire).

Au niveau du genre, le groupe D-FMT avait un indice de Shannon (P = 0, 015) et un indice de Simpson (P = 0, 003) significativement inférieurs à ceux du groupe H-FMT (Fig. 6A supplémentaire). Nous avons également trouvé des différences significatives dans la composition bactérienne au niveau du genre entre les deux groupes (P = 0, 001; Fig. 6B supplémentaire). Les microbes des deux groupes étaient principalement composés de Bacteroides et Parabacteroides (Figure 6C supplémentaire), et une analyse différentielle a identifié 24 genres, dont Bacteroides, Parabacteroides, Erysipelatoclostridium et plusieurs autres (Figure 6D supplémentaire).

Au niveau des espèces, il y avait des différences significatives dans la structure du microbiote entre les deux groupes, comme déterminé par les analyses PCoA (P = 0, 001; Fig. 4F). Les résultats de la composition microbienne ont montré que Bacteroides eggerthii, B. plebeius et B. thetaiotaomicron étaient les espèces dominantes du groupe D-FMT, tandis que B. plebeius, B. thetaiotaomicron et B. intestinalis étaient les espèces dominantes du groupe H-FMT. (Fig. 4F). Un total de 44 espèces bactériennes qui différaient significativement entre les deux groupes ont été identifiées (Fig. 4F). Il y avait également 873 KO qui différaient significativement entre les deux groupes (tableau supplémentaire 2). Treize KO ont été enrichis dans la voie de biosynthèse du LPS, dont 10 KO qui ont été régulés positivement dans le groupe D-FMT (Fig. 4F et tableau supplémentaire 2).

Nous avons évalué la similitude des microbiomes intestinaux chez les souris et les porcelets GF (Fig. 7A supplémentaire). Nous avons constaté que les microbes intestinaux des deux groupes étaient complètement appariés au niveau du phylum. Au niveau du genre, le taux d'homologie a atteint 82,71% dans le groupe sain et 80,67% dans le groupe diarrhée. Au niveau de l'espèce, le taux d'homologie a atteint 83,61 % dans le groupe sain et 63,67 % dans le groupe diarrhée.

Des analyses métabolomiques fécales ont également été effectuées sur les deux groupes de souris receveuses. La distribution globale des métabolites et la composition des métabolites dans les deux groupes sont présentées dans les Fig. 7B, C supplémentaires. Il y avait des différences significatives dans les métabolites entre ces deux groupes (Fig. 4G). Une analyse plus approfondie des données a révélé que 17 métabolites différaient entre les deux groupes, l'arginine, la propionylcarnitine, l'acide picolinique et l'acide citraconique ayant des niveaux plus élevés dans le groupe D-FMT, et l'acide 2-buténoïque, l'acide pentadécanoïque, le rhamnose, le ribulose, le xylulose , l'acide alpha-hydroxyisobutyrique, l'acide glutarique, l'acide 3-hydroxyphénylacétique, l'acide homovanillique, l'acide hydroxyphényllactique, l'acide phényllactique, l'acide 3-(3-hydroxyphényl)-3-hydroxypropanoïque et l'acide 3,4-dihydroxyhydrocinnamique ayant des niveaux significativement plus élevés dans le H -Groupe FMT (Fig. 4G). Les analyses KEGG ont révélé que le métabolisme de l'arginine et de la proline, les interconversions de pentose et de glucuronate et la biosynthèse de l'aminoacyl-ARNt étaient les voies dans lesquelles les métabolites étaient enrichis (Fig. 7D supplémentaire).

Nous avons isolé L. reuteri et L. mucosae à partir d'échantillons fécaux de porcelets nouveau-nés en bonne santé et avons étudié l'effet de ces deux lactobacilles spécifiques sur les symptômes de la maladie diarrhéique chez des souris GF diarrhéiques receveuses (Fig. 1C). En mesurant le poids corporel des souris GF au fil du temps, nous avons constaté qu'à partir du jour 5, les souris GF nourries avec L. mucosae présentaient une amélioration significative du retard de croissance causé par l'administration de la suspension de microbiote fécal diarrhéique, tandis que l'intervention L. reuteri n'était pas significativement différent du groupe D-FMT (Fig. 5A).

A Les poids corporels des souris ont été déterminés pendant la période expérimentale. B Sections de tissus iléum et côlon de souris expérimentales : la première rangée de l'image montre la coloration H&E, la deuxième rangée montre la coloration PAS et la troisième rangée montre la coloration AB (barre d'échelle, 50 μm). C Niveaux de WBC, LYM, NEU, MON, LYM%, NEU% et MON% dans le sang de souris expérimentales. D Les niveaux d'IL-1β, IL-6, IL-8, TNF-α, LPS, DAO et D-LA dans le sérum. E Les niveaux d'IL-1β, IL-6, IL-8, TNF-α, LPS, DAO et D-LA dans le tissu iléal. F Les niveaux d'IL-1β, IL-6, IL-8, TNF-α, LPS, DAO et D-LA dans le tissu du côlon. G Niveaux des protéines ZO-1, occludine, AKT et NF-κB et p-AKT et p-NF-κB dans l'iléon et le côlon. H Analyse des coordonnées principales au niveau ASV ; Abondance relative de la composition bactérienne du microbiote fécal des souris GF au niveau du phylum et du genre ; Diagramme à bulles pour l'analyse différentielle microbienne fécale au niveau du genre. n = 10 pour A–F et H ; n = 3 pour G. Les données ont été exprimées sous forme de moyennes ± SEM (A et C–F) et une ANOVA unidirectionnelle a été réalisée, suivie du test de LSD (A et C–F). *P < 0,05.

Par observation histologique du côlon et de l'iléon des souris dans les trois groupes (Fig. 5B), nous avons constaté que la longueur des villosités (P = 0,004), les mucines neutres (P = 0,028) et les mucines acides (P = 0,003) de l'iléon étaient significativement élevés dans le groupe d'intervention L. mucosae par rapport au groupe D-FMT (Fig. 4B supplémentaire). De plus, le score histopathologique du côlon était significativement plus faible (P = 0, 002; Fig. 4B supplémentaire). Les mucines neutres (P = 0, 010) et les mucines acides (P = 0, 003) du côlon étaient significativement plus élevées dans le groupe d'intervention L. mucosae par rapport au groupe D-FMT (Fig. 4B supplémentaire). Cependant, les différences entre ces indicateurs n'ont pas atteint le niveau de signification statistique lors de la comparaison de l'iléon et du côlon dans le groupe d'intervention L. reuteri à ceux du groupe D-FMT (Fig. 4B supplémentaire).

Les résultats des indices biochimiques sanguins ont montré que le groupe d'intervention L. mucosae avait des WBC significativement plus faibles (P = 0,033), LYM (P = 0,022) et LYM% (P = 0,046) par rapport au groupe D-FMT, tandis que le NEU% ( P = 0,019) était nettement plus élevé dans le groupe d'intervention L. mucosae (Fig. 5C). De plus, les taux sériques d'IL-1β (P = 0,002), d'IL-6 (P = 0,007), de TNF-α (P = 0,050), de LPS (P = 0,003), de DAO (P = 0,002) et de d- LA (P = 0,000) dans le groupe d'intervention L. mucosae étaient significativement inférieurs à ceux du groupe D-FMT (Fig. 5D). Nous avons également constaté que les niveaux d'IL-1β (P = 0,012), IL-6 (P = 0,005), IL-8 (P = 0,004), LPS (P = 0,009), DAO (P = 0,029) et d -LA (P = 0,011) dans l'iléon du groupe d'intervention L. mucosae étaient significativement inférieurs à ceux du groupe D-FMT (Fig. 5E).

Pour le côlon, les teneurs en IL-8 (P = 0,000), TNF-α (P = 0,017), LPS (P = 0,036) et D-LA (P = 0,007) étaient significativement plus faibles dans l'intervention L. mucosae groupe que dans le groupe D-FMT (Fig. 5F). Nous avons également constaté que les niveaux d'expression des protéines ZO-1 et occludine dans l'iléon et le côlon étaient significativement plus élevés dans le groupe d'intervention L. mucosae (Fig. 5G). Les niveaux de p-AKT et de p-NF-κB étaient significativement plus faibles dans le groupe d'intervention L. mucosae (Fig. 5G), et ces valeurs n'étaient pas significativement différentes entre le groupe d'intervention L. reuteri et le groupe D-FMT (Fig. .5G).

Nous avons également analysé les changements dans la structure et la composition du microbiote intestinal après l'intervention de L. mucosae (Fig. 5H). PCoA a montré que les signatures bactériennes entre les groupes d'intervention D-FMT et L. mucosae n'étaient pas significativement distinctes au niveau de la variante de séquence d'amplicon (ASV). Au niveau du phylum, Bacteroidota, Firmicutes et Fusobacteriota étaient les bactéries prédominantes dans les fèces des souris des groupes d'intervention D-FMT et L. mucosae. Au niveau du genre, Bacteroides, Fusobacterium et Bacteroidetes_vadinHA17 étaient les bactéries prédominantes dans les matières fécales des souris D-FMT et de celles recevant l'intervention L. mucosae. De plus, nous avons identifié un total de huit genres bactériens discriminants entre le groupe D-FMT et le groupe d'intervention L. mucosae. Comparé au groupe D-FMT, le groupe d'intervention L. mucosae était caractérisé par six espèces enrichies et deux espèces appauvries.

Nous avons également exploré l'effet d'atténuation de L. mucosae sur les symptômes de la maladie diarrhéique induits par ETEC K88 (Fig. 1D). Lors de la mesure du poids corporel des souris au cours de l'expérience, nous avons constaté que les souris nourries avec L. mucosae présentaient une amélioration significative du retard de croissance causé par l'infection à ETEC K88 (Fig. 6A). Par observation histologique du côlon et de l'iléon des trois groupes de souris (Fig. 6B), la longueur des villosités (P = 0,005) et le rapport de longueur des villosités à la crypte (P = 0,024) de l'iléon se sont avérés significativement élevés dans le Groupe ETEC K88 + L. mucosae comparé au groupe ETEC K88 (Fig. 6B). De plus, le score histopathologique du côlon était significativement plus faible (P = 0,000 ; Fig. 6B) dans le groupe d'intervention. Les taux sériques, iléaux et côlonaux d'IL-1β (P = 0,004/0,025/0,021), d'IL-6 (P = 0,022/0,001/0,015), de TNF-α (P = 0,002/0,010/0,016), de LPS ( P = 0,018/0,001/0,000), DAO (P = 0,003/0,000/0,004) et D-LA (P = 0,003/0,000/0,019) dans le groupe ETEC K88 + L. mucosae étaient significativement inférieurs à ceux du groupe ETEC Groupe K88 (Fig. 6C–E). Les niveaux d'expression des protéines ZO-1 et occludine dans l'iléon et le côlon étaient significativement plus élevés dans le groupe ETEC K88 + L. mucosae que dans le groupe ETEC K88, alors que les niveaux de p-AKT et p-NF-κB étaient significativement plus élevés. inférieur (Fig. 6F).

A Les poids corporels des souris ont été déterminés pendant la période expérimentale. Coloration B H&E dans les coupes de tissus de l'iléon et du côlon de souris expérimentales ; La longueur des villosités, la longueur de la crypte, le rapport des villosités à la longueur de la crypte de l'iléon et le score histopathologique du côlon (barre d'échelle, 50 μm). C Les niveaux d'IL-1β, IL-6, IL-8, TNF-α, LPS, DAO et D-LA dans le sérum. D Les niveaux d'IL-1β, IL-6, IL-8, TNF-α, LPS, DAO et D-LA dans le tissu iléal. E Les niveaux d'IL-1β, IL-6, IL-8, TNF-α, LPS, DAO et D-LA dans le tissu du côlon. F Niveaux des protéines ZO-1, occludine, AKT et NF-κB et p-AKT et p-NF-κB dans l'iléon et le côlon. G Analyse des coordonnées principales au niveau ASV ; Abondance relative de la composition bactérienne du microbiote fécal des souris au niveau du phylum et du genre ; Diagramme à bulles pour l'analyse différentielle microbienne fécale au niveau ASV. n = 6 pour A–E et G ; n = 3 pour F. Les données ont été exprimées sous forme de moyennes ± SEM (A–E) et une ANOVA unidirectionnelle a été effectuée, suivie du test de LSD (A–E). * P < 0,05.

Nous avons également analysé les changements dans la structure et la composition du microbiote intestinal après l'intervention de L. mucosae (Fig. 6G). La PCoA a montré que les signatures bactériennes entre les trois groupes n'étaient pas significativement distinctes au niveau de l'ASV. Au niveau du phylum, Firmicutes, Bacteroidota et Campilobacterota étaient les bactéries prédominantes dans les fèces des souris ETEC K88, tandis que Firmicutes, Bacteroidota et Proteobacteria étaient les bactéries prédominantes dans les fèces des souris ETEC K88 + L. mucosae. Au niveau du genre, Lactobacillus, Bacteroidetes_vadinHA17 et Alistipes étaient les bactéries prédominantes dans les matières fécales des souris ETEC K88 et ETEC K88 + L. mucosae. Nous avons identifié un total de deux microbes discriminants entre les groupes ETEC K88 et ETEC K88 + L. mucosae au niveau de l'ASV ; par rapport au groupe ETEC K88, le groupe ETEC K88 + L. mucosae était caractérisé par deux bactéries enrichies. Les caractéristiques du microbiote intestinal dans les groupes témoin et ETEC K88 + L. mucosae à la fin de l'intervention L. mucosae mais avant le défi ETEC K88 sont présentées dans la Fig. 8 supplémentaire.

Nous avons en outre exploré l'effet d'atténuation des véhicules électriques dérivés de L. mucosae sur les symptômes de la maladie diarrhéique causés par ETEC K88 (Fig. 1E). La microscopie électronique à transmission (TEM) a été utilisée pour confirmer la présence d'EV dans les cultures de L. mucosae (Fig. 7A). Les véhicules électriques de L. mucosae (LmEV) ont également été quantifiés par analyse de suivi des nanoparticules (NTA) (Fig. 7B). L'analyse biochimique a révélé que les LmEV contenaient de l'ADN, de l'ARN et des protéines, et que la teneur en protéines était nettement supérieure à celle de l'ADN ou de l'ARN (Fig. 9 supplémentaire). Après co-incubation avec des cellules MODE-K ou IPEC-J2 pendant 6 h, des LmEV marqués au DiI (signal rouge) ont été trouvés dans le cytoplasme de ces cellules, suggérant que les LmEV étaient internalisés par les cellules épithéliales intestinales (Fig. 10 supplémentaire). En mesurant le poids corporel des souris au cours de l'expérience, nous avons déterminé que les souris nourries avec des véhicules électriques dérivés de L. mucosae présentaient une amélioration significative du retard de croissance causé par l'infection à ETEC K88 (Fig. 7C). Lors de l'observation histologique du côlon et de l'iléon des trois groupes de souris (Fig. 7D), le score histopathologique du côlon a été déterminé comme étant significativement plus faible dans le groupe d'intervention (P = 0, 000; Fig. 7D). De plus, les taux sériques, iléaux et côlonaux d'IL-1β (P = 0,000/0,001/0,000), IL-6 (P = 0,001/0,025/0,000), TNF-α (P = 0,000/0,011/0,004) , LPS (P = 0,001/0,014/0,000), DAO (P = 0,000/0,006/0,003) et d-LA (P = 0,000/0,001/0,000) dans le groupe ETEC K88 + LmEVs étaient significativement inférieurs à ceux du groupe Groupe ETEC K88 (Fig. 7E–G). Nous avons également constaté que les niveaux d'expression des protéines Arg1, ZO-1 et occludine dans l'iléon et le côlon étaient significativement plus élevés dans le groupe ETEC K88 + LmEVs que dans le groupe ETEC K88, alors que l'expression d'iNOS et les niveaux de p Les protéines -AKT et p-NF-κB étaient significativement plus faibles (Fig. 7H).

Un TEM d'EV isolés (barre d'échelle, 200 ou 100 nm). B Distribution de taille des véhicules électriques analysés par NTA. C Poids corporels des souris pendant la période expérimentale. Coloration D H&E de coupes de tissus d'iléon et de côlon de souris expérimentales ; Mesures de la longueur des villosités, de la longueur de la crypte et des rapports de longueur des villosités à la crypte de l'iléon et des scores histopathologiques du côlon (barre d'échelle, 50 μm). Niveaux d'IL-1β, IL-6, TNF-α, LPS, DAO et D-LA dans E le sérum, F le tissu iléal et G le tissu du côlon. H Expression des protéines iNOS, Arg1, ZO-1, occludine, AKT et NF-κB et niveaux de p-AKT et p-NF-κB dans l'iléon et le côlon. I Analyse des coordonnées principales au niveau ASV ; Abondance relative de la composition bactérienne du microbiote fécal des souris au niveau du phylum et du genre ; Diagramme à bulles pour l'analyse différentielle microbienne fécale au niveau ASV. n = 3 pour A et B ; n = 6 pour C, E–G et I ; n = 5/6 pour D ; n = 3 pour H. Les données ont été exprimées sous forme de moyennes ± SEM (C – G) et une ANOVA unidirectionnelle a été effectuée, suivie du test de LSD (C – G). *P < 0,05.

Nous avons également analysé les changements dans la structure et la composition du microbiote intestinal après intervention LmEV (Fig. 7I). PCoA a montré que les signatures bactériennes parmi les trois groupes étaient significativement distinctes au niveau de l'ASV. Au niveau du phylum, Bacteroidota, Firmicutes et Campilobacterota étaient les bactéries prédominantes dans les matières fécales des souris des groupes ETEC K88 et ETEC K88 + LmEVs. Au niveau du genre, Muribaculaceae, Alistipes et Lactobacillus étaient les bactéries prédominantes dans les matières fécales du groupe ETEC K88, tandis que Muribaculaceae, Lactobacillus et Alistipes étaient les bactéries prédominantes dans les matières fécales des souris ETEC K88 + LmEVs. De plus, nous avons identifié un total de 27 bactéries discriminantes entre les groupes ETEC K88 et ETEC K88 + LmEVs au niveau ASV ; par rapport au groupe ETEC K88, le groupe ETEC K88 + LmEVs était caractérisé par 13 bactéries enrichies et par 14 bactéries appauvries.

Pour élucider le rôle des macrophages dans l'atténuation des symptômes de la maladie diarrhéique induits par le défi ETEC K88 par les LmEV, nous avons effectué une expérience d'élimination des macrophages (Fig. 1F). Aucune différence n'a été trouvée dans les changements de poids corporel entre les souris éliminées par les macrophages et testées avec ETEC K88 (le groupe ETEC K88-E) et les souris ETEC K88-E nourries avec des LmEV (le groupe ETEC K88 + LmEVs-E) (Fig. 8A). Il n'y avait aucune différence significative dans la longueur des villosités jéjunales, la longueur des cryptes, le rapport de longueur des villosités à la crypte ou les scores d'histopathologie colique entre les groupes ETEC K88 + LmEVs-E et ETEC K88-E (Fig. 8B). Il n'y avait pas non plus de différences évidentes dans les taux sériques, iléaux et côlonaux d'IL-1β, IL-6, TNF-α, LPS, DAO et d-LA entre les groupes ETEC K88 + LmEVs-E et ETEC K88-E ( Fig. 8C–E).

A Poids corporels des souris au cours de la période expérimentale. Coloration B H&E de coupes de tissu iléal et côlon de souris expérimentales ; Mesures de la longueur des villosités, de la longueur de la crypte et du rapport de longueur des villosités à la crypte de l'iléon et des scores histopathologiques du côlon (barre d'échelle, 50 μm). Les niveaux d'IL-1β, IL-6, TNF-α, LPS, DAO et D-LA dans le sérum C, les tissus de l'iléon D et les tissus du côlon E. F Analyse des coordonnées principales au niveau ASV ; Abondance relative de la composition bactérienne du microbiote fécal des souris au niveau du phylum et du genre ; Diagramme à bulles pour l'analyse différentielle microbienne fécale au niveau ASV. n = 6 pour A–F. Les données ont été exprimées sous forme de moyennes ± SEM (A – E) et une ANOVA à une voie a été effectuée, suivie du test de LSD (A – E). *P < 0,05.

Les changements dans la structure et la composition du microbiote intestinal après l'intervention du LmEV sont illustrés à la Fig. 8F. La PCoA a montré que les signatures bactériennes entre les trois groupes n'étaient pas significativement distinctes au niveau de l'ASV. Au niveau du phylum, Firmicutes, Bacteroidota et Proteobacteria étaient les bactéries prédominantes dans les matières fécales des souris ETEC K88-E et des souris ETEC K88 + LmEV-E. Au niveau du genre, Lactobacillus, Muribaculaceae et Acinetobacter étaient le genre le plus dominant dans les matières fécales des souris ETEC K88-E, tandis que Lactobacillus, Muribaculaceae et Alistipes étaient le genre le plus dominant dans les matières fécales des souris ETEC K88 + LmEV-E. De plus, nous avons identifié un total de huit microbes discriminants entre les groupes ETEC K88-E et ETEC K88 + LmEVs-E au niveau ASV. Par rapport au groupe ETEC K88-E, le groupe ETEC K88 + LmEVs-E a été caractérisé par quatre bactéries enrichies et par quatre bactéries appauvries.

Les maladies diarrhéiques sont un problème de santé mondial pour les humains et le bétail38. On estime que la diarrhée touche des millions de patients et que les maladies diarrhéiques entraînent des milliards de dollars de dépenses médicales dans le monde chaque année39. On suppose que la diarrhée est causée en partie par une dysbiose du microbiote intestinal, qui agit comme un lien entre le phénotype de la maladie de l'hôte et la fonction physiologique des tissus et des organes24. Il est donc essentiel d'élucider les mécanismes sous-jacents aux troubles diarrhéiques, notamment du point de vue du microbiote intestinal, afin de développer de nouvelles stratégies de prévention et de traitement. Ici, nous avons d'abord utilisé des porcelets néonataux sains et diarrhéiques comme modèles pour révéler systématiquement les caractéristiques des microbiomes intestinaux néonatals dans ces différentes conditions, et nous avons identifié des souches probiotiques potentielles spécifiques qui distinguent les individus sains et diarrhéiques. Deuxièmement, nous avons transplanté le microbiote fécal de porcelets néonatals sains et diarrhéiques à des souris GF afin d'élucider les mécanismes moléculaires par lesquels le microbiote intestinal désordonné des nouveau-nés diarrhéiques entraînait des lésions intestinales et un retard de croissance. De plus, nous avons réalisé des essais d'intervention utilisant des composants probiotiques spécifiques isolés d'individus en bonne santé et avons démontré une efficacité de soulagement supérieure contre les symptômes des maladies diarrhéiques. Enfin, nous avons démontré que les véhicules électriques dérivés de probiotiques modulaient les phénotypes des macrophages pour contrer les symptômes des maladies diarrhéiques.

L'utilisation de porcelets nouveau-nés comme modèle translationnel a permis d'élucider les caractéristiques du microbiote intestinal d'individus sains et diarrhéiques. Les résultats de notre analyse métagénomique ont montré que les porcelets nouveau-nés atteints de diarrhée souffrent bien d'un trouble du microbiote intestinal, qui se caractérise par une structure du microbiote intestinal distincte de celle des individus sains. Lactobacilles spp. sont actuellement reconnus comme des probiotiques qui jouent un rôle important dans le maintien de l'homéostasie du microbiote intestinal40. Nos données ont révélé que Lactobacillus spp. sont en abondance relative la plus élevée dans les intestins des nouveau-nés sains et diarrhéiques, mais que Lactobacillus spp. et certaines espèces spécifiques de Lactobacillus sont significativement déficientes dans les intestins des nouveau-nés souffrant de diarrhée. Nous avons en outre identifié L. reuteri et L. mucosae comme des micro-organismes clés qui distinguaient les nouveau-nés sains et diarrhéiques à l'aide de modèles forestiers aléatoires. E. coli est le principal agent pathogène entérique responsable des maladies diarrhéiques, et les enfants de moins de 5 ans sont sensibles à l'infection à E. coli41. Dans notre étude, Escherichia était le deuxième genre prédominant dans les fèces des porcelets nouveau-nés diarrhéiques. De plus, bien qu'aucune différence statistique n'existe, l'abondance relative d'E. coli dans les matières fécales des porcelets souffrant de diarrhée était le double de celle des porcelets sains. Le LPS est un facteur de virulence classique produit par E. coli qui provoque la diarrhée42,43, et notre analyse fonctionnelle KEGG a révélé que la biosynthèse du LPS était significativement plus élevée chez les porcelets nouveau-nés diarrhéiques que chez les porcelets nouveau-nés sains. Les Fusobactéries sont un petit groupe de bactéries Gram-négatives, dont les Fusobactéries se trouvent couramment dans le tube digestif des humains et des animaux. La principale espèce représentative de Fusobacterium est Fusobacterium nucleatum, qui s'est avérée fortement associée à l'inflammation intestinale et au cancer colorectal44,45. Dans notre étude, le niveau de Fusobactéries était significativement plus élevé chez le porcelet nouveau-né diarrhéique, ce qui suggère que Fusobacterium pourrait être un médiateur intermédiaire de l'inflammation intestinale chez les porcelets souffrant de diarrhée induite par E. coli. Notre recherche favorise l'élucidation des mécanismes potentiels par lesquels les lactobacilles atténuent les maladies diarrhéiques plutôt que la pathogenèse de la diarrhée, nous avons donc laissé l'étude des bactéries pathogènes à des travaux futurs. Les présents résultats suggèrent que la provocation par E. coli et la surproduction de LPS sont des facteurs de risque importants de diarrhée néonatale, tandis que l'absence de Lactobacillus affaiblit gravement la résistance à l'invasion pathogène du microbiote intestinal néonatal.

En plus de son potentiel en tant que thérapie pour des maladies complexes, la FMT a également contribué à révéler le lien intrinsèque entre les microbes intestinaux et les phénotypes de la maladie de l'hôte et les fonctions physiologiques des tissus et des organes46,47,48. Dans notre étude, la transplantation de microbiote fécal de porcelets diarrhéiques à des souris GF a induit un retard de croissance important accompagné de réponses inflammatoires systémiques sévères. Conformément aux résultats chez les porcelets nouveau-nés, il y avait des différences significatives dans la structure du microbiote intestinal entre les souris GF qui recevaient des échantillons microbiens de porcelets sains et diarrhéiques. Bien que la grande majorité du microbiote intestinal des souris receveuses soit issue de porcs donneurs, la composition spécifique du microbiote intestinal des souris a été radicalement altérée, un phénomène commun à de nombreuses études FMT49,50. Les Bacteroides jouent un rôle important dans les interactions microbiote intestinal-hôte, et des études antérieures ont montré que les Bacteroides peuvent réguler la production de cytokines pro-inflammatoires51,52. Nos données ont montré que les Bacteroides étaient dominants dans le microbiote intestinal des deux groupes de souris et que l'abondance relative des Bacteroides dans les fèces des souris receveuses diarrhéiques était significativement plus élevée que celle des souris receveuses saines. Notamment, certaines voies fonctionnelles liées au microbiote intestinal ont été transférées des porcs donneurs aux souris receveuses, comme la biosynthèse du LPS. De manière constante, nos résultats ont montré que les concentrations sériques de LPS étaient significativement plus élevées chez les souris receveuses diarrhéiques que chez les souris receveuses saines. Les métabolites fécaux sont considérés comme une lecture fonctionnelle du microbiote intestinal53, et il y avait également des différences significatives entre les métabolites fécaux des deux groupes de souris receveuses dans notre étude. Les résultats de l'identification des métabolites différentiels ont montré que certains métabolites à potentiel anti-inflammatoire (acide 3,4-dihydroxyhydrocinnamique54, acide homovanillique55 et acide phényllactique56) étaient significativement enrichis chez les souris receveuses saines, alors qu'un métabolite pro-inflammatoire (acide picolinique57) a été enrichi chez des souris receveuses diarrhéiques. Ces données impliquent que la perturbation du microbiote intestinal et de ses métabolites chez les nouveau-nés diarrhéiques est responsable du retard de croissance et des réponses inflammatoires secondaires aux maladies diarrhéiques.

En plus d'entraîner une mortalité infantile élevée, les maladies diarrhéiques sont un facteur important de dysplasie intestinale58,59. La dysplasie intestinale se manifeste principalement par un système immunitaire de la muqueuse intestinale peu développé et une altération de la fonction de barrière intestinale, ce qui augmente la perméabilité intestinale et la translocation bactérienne, provoquant des réponses inflammatoires systémiques et aboutissant finalement à un retard de croissance néonatal60. Dans cette étude, le microbiote intestinal perturbé des porcelets diarrhéiques a causé des effets profonds sur le développement intestinal chez les souris GF receveuses, principalement sous la forme de changements spectaculaires dans les profils d'expression génique de tous les tissus du segment intestinal (duodénum, ​​jéjunum, iléon, caecum et côlon). ). L'analyse d'enrichissement KEGG a révélé que les gènes différentiels dans les cinq segments intestinaux étaient principalement mappés sur les voies de signalisation inflammatoires et immunitaires, telles que les voies de signalisation NF-κB et PI3K-AKT. NF-κB et AKT sont des molécules protéiques importantes qui interviennent dans les réponses inflammatoires et sont phosphorylées pour activer leurs fonctions biologiques61,62. Nos résultats ont montré que la phosphorylation de NF-κB et d'AKT est élevée dans les intestins de souris receveuses diarrhéiques, avec des niveaux similaires de cytokines pro-inflammatoires dans les tissus intestinaux. L'immunodéficience et les réponses inflammatoires altèrent la fonction de barrière intestinale, perturbent la morphologie et la structure intestinales et augmentent la perméabilité intestinale, entraînant ainsi l'infiltration de substances nocives telles que le LPS de la lumière intestinale dans la circulation sanguine63,64. De manière constante, la transplantation de microbiote fécal de porcelets diarrhéiques a gravement détérioré les protéines des jonctions serrées intestinales et la morphologie intestinale chez les souris receveuses. Ces résultats démontrent que le microbiote intestinal désordonné des nouveau-nés diarrhéiques induit une réponse inflammatoire locale dans l'intestin par l'activation des voies de signalisation inflammatoires, ce qui entraîne à son tour des anomalies du développement intestinal.

Dans la pratique clinique, la FMT a été largement utilisée dans les tentatives de guérison des troubles gastro-intestinaux, et elle a montré une certaine efficacité65,66. Une étude précédente a révélé que la FMT réduisait la gravité de la maladie en augmentant l'abondance relative des probiotiques67. Comme mentionné ci-dessus, nous avons identifié L. reuteri et L. mucosae comme des micro-organismes intestinaux clés qui font la distinction entre les nouveau-nés sains et diarrhéiques. Pour vérifier si leur reconstitution pouvait sauver le retard de croissance et les dommages intestinaux induits par le microbiote intestinal provoqué par la diarrhée, nous avons en outre mené des expériences d'intervention probiotiques. Des études antérieures ont montré que L. reuteri et L. mucosae ont une capacité anti-inflammatoire68,69. En conséquence, nos données ont montré que L. mucosae, mais pas L. reuteri, supprimait efficacement la réponse inflammatoire et les dommages intestinaux en inhibant la synthèse de LPS et la phosphorylation de NF-κB et AKT, atténuant ainsi efficacement le retard de croissance causé par le microbiote intestinal provoqué par la diarrhée et Infection à ETEC K88. Les probiotiques protègent généralement la santé de l'hôte en tuant directement les bactéries pathogènes ou en remodelant le microbiote intestinal pour améliorer la résistance à la colonisation par des bactéries pathogènes18,24,70. Dans notre étude, l'intervention de L. mucosae a augmenté de manière significative l'abondance fécale de Lactobacillus spp. Chez la souris. Ces données suggèrent que L. mucosae d'individus sains joue un rôle important dans la résistance à la diarrhée et aux lésions intestinales en régulant le microbiote intestinal. Cependant, les mécanismes par lesquels L. mucosae régule l'homéostasie intestinale de l'hôte pour soulager les maladies diarrhéiques doivent être mieux élucidés.

La régulation microbienne des fonctions physiologiques de l'hôte peut être médiée par des médiateurs actifs sécrétés par le microbiote en plus des interactions directes avec l'hôte71,72. Parmi les différents médiateurs d'origine bactérienne, il a été démontré que les véhicules électriques jouent un rôle clé dans la diaphonie et la signalisation intercellulaires73. La communication entre les probiotiques et les cellules hôtes par la sécrétion d'EV a attiré l'attention de la communauté scientifique. Des études récentes ont montré que certains véhicules électriques dérivés de probiotiques jouent des rôles similaires à ceux de leurs bactéries parentales74,75. Dans cette étude, nous avons isolé et identifié avec succès les véhicules électriques dérivés de L. mucosae. En outre, nous avons également démontré que les LmEV exerçaient une meilleure efficacité que L. mucosae pour soulager les symptômes des maladies diarrhéiques. Une étude récente a montré que les VE dérivés de L reuteri DSM 17938 peuvent à eux seuls reproduire complètement les effets de leurs bactéries parentales sur la motilité intestinale76. De plus, il existe des preuves que les véhicules électriques dérivés de L reuteri DSM 17938 et de BG-R46 améliorent la fonction de barrière intestinale lorsqu'ils sont absorbés par les cellules épithéliales intestinales, réduisant ainsi les fuites causées par ETEC77. Les véhicules électriques de L reuteri BBC3 peuvent également être captés par les macrophages pour moduler la réponse immunitaire78. Cependant, nos données ont révélé que L reuteri n'a pas réussi à soulager les symptômes de la maladie diarrhéique, nous n'avons donc pas effectué d'expériences de suivi avec des véhicules électriques dérivés de L reuteri. Le L reuteri utilisé dans notre étude a été isolé des excréments de porcelets nouveau-nés en bonne santé, ce qui diffère de la souche modèle utilisée dans les rapports ci-dessus, et la variabilité entre les souches est probablement une raison importante des différents résultats. Une étude précédente a montré que L reuteri DSM 17938 ou ses EV peuvent diminuer la durée de la diarrhée aiguë et de l'hospitalisation pour gastro-entérite aiguë, mais ne semble pas prévenir la diarrhée nosocomiale ou la diarrhée associée aux antibiotiques79, indiquant que même les effets bénéfiques de la même souche peuvent différer selon les conditions pathologiques.

Les macrophages, en tant que cellules centrales qui initient et régulent la réponse inflammatoire, peuvent produire une variété de cytokines, favoriser la prolifération des cellules épithéliales intestinales, réguler l'intégrité de la barrière épithéliale et jouer un rôle important dans le maintien de l'homéostasie intestinale. En fonction des signaux convergents des stimuli inflammatoires et de l'environnement cellulaire, les différentes phases d'activation des macrophages sont largement décrites comme une polarisation pro-inflammatoire M1 et anti-inflammatoire M282,83. Des études récentes ont montré un effet régulateur des voies de signalisation NF-κB et AKT sur les phénotypes macrophages84,85. Nos données ont montré que l'intervention EV activait la polarisation des macrophages M2 et inhibait la polarisation des macrophages de type M1, ainsi que supprimait l'expression des protéines régulatrices inflammatoires (NF-κB et AKT). Notamment, les véhicules électriques ont perdu la capacité d'atténuer les symptômes de la maladie diarrhéique dans un modèle murin d'élimination des macrophages. Ces résultats ont indiqué que les LmEV combattent la diarrhée en modulant la réponse inflammatoire d'une manière dépendante des macrophages.

En conclusion, les troubles du microbiote intestinal chez les porcelets diarrhéiques étaient caractérisés par une altération de la structure du microbiote, l'absence de Lactobacillus, une prolifération excessive d'E. coli et une biosynthèse de LPS. L. mucosae et L. reuteri étaient des microbes clés potentiels qui distinguent les porcelets sains des porcelets diarrhéiques. Le microbiote intestinal induit par la diarrhée a transmis avec succès des phénotypes de maladies diarrhéiques tels qu'un retard de croissance, des réponses inflammatoires et des lésions intestinales aux souris GF. Mécaniquement, le microbiote intestinal désordonné des nouveau-nés diarrhéiques a activé les voies de signalisation pro-inflammatoires via le LPS, entraînant des structures morphologiques intestinales perturbées, une fonction de barrière intestinale affaiblie et une perméabilité intestinale accrue. Une translocation excessive de LPS de la lumière intestinale vers la circulation sanguine a induit une réponse inflammatoire systémique, conduisant finalement à un retard de croissance. L. mucosae isolée des matières fécales de porcelets nouveau-nés en bonne santé a exercé son effet antidiarrhéique supérieur en réduisant la réponse inflammatoire et les lésions intestinales. Les véhicules électriques dérivés de L. mucosae régulaient l'homéostasie intestinale en activant les macrophages M2 et en inhibant les macrophages M1, atténuant ainsi les symptômes des maladies diarrhéiques. Dans l'ensemble, en régulant l'activité des macrophages par la libération d'EV, L. mucosae a amélioré la maladie causée par les microbes intestinaux. Les principaux résultats de notre étude sont résumés dans la Fig. 9. Ces résultats fournissent une stratégie potentielle pour la prévention du risque de diarrhée chez les nouveau-nés.

Diagramme schématique résumant les résultats de la présente étude.

Des échantillons fécaux de porcelets nouveau-nés en bonne santé ont été sélectionnés au hasard pour l'isolement de Lactobacillus. Des échantillons de matières fécales congelées (200 mg) ont été mis en suspension dans un tampon salin tamponné au phosphate stérile (PBS) et complètement perturbés par pipetage afin de créer une suspension bactérienne. Cette suspension a été diluée avec un gradient de dix fois dans du PBS stérile, et des volumes égaux (100 μL) de chaque dilution ont été étalés sur un milieu de gélose de Man, Rogosa et Sharpe (MRS) et incubés en anaérobiose à 37 ° C pendant 24 h. Des colonies uniques avec différentes morphologies ont été sélectionnées à l'aide de boucles d'inoculation à partir de plaques produites avec différentes dilutions, et les bactéries ont été purifiées par traçage sur un nouveau milieu de gélose MRS et incubées les plaques en anaérobiose à 37 ° C pendant 24 h. Après quatre cycles de purification, des colonies individuelles ont été transférées des plaques de gélose MRS dans 500 μL de bouillon MRS, et le liquide a été transféré dans des conditions anaérobies à 15 mL de bouillon MRS et incubé à 37 ° C pendant 24 h. Lorsque le bouillon MRS était trouble, l'ADN a été extrait d'une partie du bouillon bactérien. Les amorces universelles 27 F (5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3') et 1492 R (5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3') ont été utilisées pour amplifier le gène d'ARNr 16S de la souche unique, et le produit de PCR a été séquencé par la méthode Sanger. Une autre portion de la solution bactérienne a été mélangée avec un volume égal de glycérol stérile à 50 % et stockée à -80 °C. Les séquences du gène de l'ARNr 16S ont été utilisées pour scanner la base de données de séquences de nucléotides du NCBI afin d'identifier les souches de L. reuteri et L. mucosae.

Les véhicules électriques ont été isolés à partir de surnageants de culture de bactéries L. mucosae78,86. Brièvement, des cultures bactériennes au stade logarithmique de croissance ont été centrifugées à 8000 × g pendant 30 min. Le surnageant a été récupéré et centrifugé à nouveau à 20 000 × g pendant 45 min. Ce surnageant a ensuite été passé à travers un filtre de 0,22 μm (Millipore) et le filtrat a été centrifugé dans un rotor SW 32 Ti (Beckman Coulter, Fullerton, CA, USA) à 120 000 × g pendant 2 h à 4 °C. Le surnageant a été jeté et le sédiment a été remis en suspension dans du PBS, et la suspension a été filtrée et recentrifugée à 120 000 × g pendant 2 h à 4 °C. Après centrifugation, le sédiment a été recueilli dans du PBS. La présence d'EV a été confirmée par TEM et la gamme de diamètres de particules des EV a été déterminée par NTA.

La teneur en protéines des LmEV a été déterminée par le kit d'analyse de protéines Solarbio BCA (Solarbio, #PC0020) en suivant les instructions du fabricant. L'ADN et l'ARN dans les LmEV ont été quantifiés en utilisant le kit de test Qubit™ dsDNA HS Assay (YEASEN, #12640ES60) et le kit de test Qubit™ RNA HS (Invitrogen, #Q32852) en suivant les instructions du fabricant, respectivement. Le contenu des protéines, de l'ADN et de l'ARN a été normalisé en utilisant 1 × 109 particules de vésicules. La quantité de LmEV utilisée dans les expériences suivantes était basée sur la teneur en protéines.

Les cellules MODE-K et IPEC-J2 ont été cultivées dans du DMEM additionné de 10 % de sérum bovin fœtal, 100 U/mL de pénicilline et 100 μg/mL de streptomycine dans une atmosphère de 5 % de CO2 à 37 °C. Le milieu de culture cellulaire a été remplacé par une solution saline équilibrée de Hank, et après 15 min d'incubation, des LmEV marqués DiI (Sigma, # 42364) (10 μg / mL) ont été ajoutés et les cellules ont été incubées pendant 6 h. Les cellules Dil-positives ont été analysées à l'aide d'un microscope à fluorescence.

Toutes les procédures d'expérimentation animale et de collecte d'échantillons ont été approuvées par le Comité institutionnel de protection et d'utilisation des animaux de l'Université agricole de Huazhong, Hubei, Chine. Dans cette étude, toutes les méthodes expérimentales ont été réalisées conformément au guide de santé de l'Université agricole de Huazhong pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire (numéro d'approbation HZAUMO-2022-0005).

Les porcelets nouveau-nés utilisés dans cette étude ont été obtenus auprès de Guangxi Yangxiang Co., Ltd. Après la livraison, 30 portées de porcelets ont été sélectionnées, et un porcelet diarrhéique et un porcelet en bonne santé ont été sélectionnés dans chaque portée. Les porcelets avec des matières fécales liquides et aqueuses pendant au moins 2 jours consécutifs ont été classés comme porcelets diarrhéiques, tandis que les porcelets ne présentant pas de diarrhée ou d'autres maladies ont été classés comme porcelets sains87. Des échantillons fécaux ont été prélevés sur des porcelets nouveau-nés (30 porcelets diarrhéiques et 30 porcelets sains), dont l'âge variait de 8 à 11 jours (tableau supplémentaire 3). Tous les porcelets sélectionnés n'ont reçu aucun antibiotique, probiotique ou prébiotique avant le prélèvement de l'échantillon. Les échantillons de selles collectés ont été divisés en deux parties : l'une a été immédiatement congelée instantanément dans de l'azote liquide et l'autre a été mélangée dans une solution stérile de glycérol-PBS (15 % de glycérol) puis congelée dans de l'azote liquide. Tous les échantillons ont été stockés à -80 °C.

Pour préparer les solutions FMT, des échantillons fécaux de porcelets diarrhéiques ou de porcelets sains ont été manipulés dans des conditions anaérobies. Les échantillons fécaux regroupés ont été centrifugés à 100 × g pendant 2 min et le surnageant a été filtré à travers un filtre de 70 μm88.

Vingt souris GF (Kunming, 4 semaines d'âge) ont été logées dans un environnement d'isolement stérile. La nourriture et l'eau étaient disponibles à volonté. Les souris ont été réparties au hasard en groupes H-FMT (n = 10) ou D-FMT (n = 10). Le groupe H-FMT a reçu 200 μL d'une suspension de microbiote fécal de porcelets sains par gavage une fois par jour le matin pendant une semaine, et le groupe D-FMT a reçu une quantité équivalente d'une suspension de microbiote fécal de porcelets diarrhéiques. Les animaux ont été élevés normalement la deuxième semaine. Les poids corporels des souris traitées ont été déterminés chaque matin pendant toute la période expérimentale. Des échantillons de matières fécales ont été collectés à la fin de la période expérimentale et les selles fraîchement collectées ont été rapidement immergées dans de l'azote liquide et stockées à -80 ° C. Toutes les souris ont été sacrifiées par dislocation cervicale. Des échantillons histologiques du duodénum, ​​du jéjunum, de l'iléon, du caecum et du côlon ont été rincés avec du PBS pour éliminer le contenu intestinal et fixés dans du paraformaldéhyde à 4 %. Le reste des tissus du duodénum, ​​du jéjunum, de l'iléon, du caecum et du côlon a été prélevé et stocké à -80 ° C. Le sang veineux a été prélevé au coin interne de l'œil. Au total, deux types d'échantillons sanguins ont été prélevés. L'un des échantillons était du sang total, qui a été recueilli dans des tubes d'anticoagulation EDTA de 0,5 ml pour des tests de paramètres hématologiques. Le deuxième échantillon de sang a été laissé au repos pendant environ 30 min à température ambiante puis centrifugé pendant 10 min à 1000 × g.

Trente souris GF (Kunming, 4 semaines d'âge) ont été divisées en trois groupes : un groupe D-FMT (n = 10), un groupe D-FMT + L. reuteri (n = 10) et un groupe D-FMT + L groupe des muqueuses (n = 10). La nourriture et l'eau ont été fournies à volonté. Le groupe D-FMT a reçu par gavage 100 μL d'une suspension de microbiote fécal dérivé de porcelets diarrhéiques et 100 μL de PBS quotidiennement pendant la première semaine, puis 200 μL de PBS quotidiennement pendant la deuxième semaine. Le groupe D-FMT + L. reuteri et le groupe D-FMT + L. mucosae ont reçu par gavage 100 μL d'une suspension de microbiote fécal de porcelets diarrhéiques et 100 μL de suspension de bactéries L. reuteri ou L. mucosae (1010 UFC/mL ), respectivement, quotidiennement pendant la première semaine, et 200 μL de PBS quotidiennement pendant la deuxième semaine. Les poids corporels de toutes les souris ont été déterminés chaque matin. Les procédures de collecte d'échantillons étaient les mêmes que celles utilisées dans la deuxième expérience d'essai sur des animaux.

Un total de 18 souris SPF (BALB/c, âgées de 4 semaines) ont été utilisées dans cette expérience. Les souris ont été réparties au hasard en trois groupes : (1) groupe CON (n = 6) ; (2) Groupe ETEC K88 (n = 6) ; et (3) groupe ETEC K88 + L. mucosae (n = 6). Des souris de la souche ETEC K88 (sérotype O149:K91, K88ac) ont été gracieusement fournies par le professeur Wang de l'Université agricole de Chine (Pékin, Chine). Pendant les trois premières semaines de l'expérience, les souris des groupes CON et ETEC K88 ont reçu 200 μL de PBS par jour par gavage, et le groupe ETEC K88 + L. mucosae a reçu 200 μL d'une suspension de L. mucosae (1010 UFC/ mL) par jour. Par la suite, 200 μL de PBS ont été injectés par voie intrapéritonéale dans le groupe CON, et 200 μL d'ETEC K88 (2 × 108 UFC/mL) ont été injectés par voie intrapéritonéale dans les groupes ETEC K88 et ETEC K88 + L. mucosae, et des échantillons ont été prélevés 5 jours plus tard. Les poids corporels de toutes les souris ont été déterminés chaque matin. Les procédures de collecte d'échantillons étaient les mêmes que celles utilisées dans la deuxième expérience d'essai sur des animaux.

Un total de 18 souris SPF (BALB/c, âgées de 4 semaines) ont été utilisées dans cette expérience. Les souris ont été réparties au hasard en trois groupes : (1) groupe CON (n = 6) ; (2) Groupe ETEC K88 (n = 6) ; et (3) groupe ETEC K88 + LmEVs (n = 6). Les souris du groupe CON ont reçu une injection intrapéritonéale de 200 μL de PBS, et les souris des groupes ETEC K88 et ETEC K88 + LmEVs ont reçu une injection intrapéritonéale de 200 μL d'ETEC K88 (2 × 108 UFC/mL). Au cours des cinq jours consécutifs suivants, les souris des groupes CON et ETEC K88 ont reçu quotidiennement 200 μL de PBS par voie orale, et les souris du groupe ETEC K88 + LmEVs ont reçu 50 μg de LmEVs dans 200 μL de PBS par voie orale. Les doses de traitement des LmEV ont été utilisées selon notre étude précédente89. Les poids corporels de toutes les souris ont été enregistrés chaque matin. Les procédures de collecte d'échantillons étaient les mêmes que celles utilisées dans la deuxième expérience d'essai sur des animaux.

L'élimination des macrophages a été réalisée par injection intrapéritonéale de liposomes de clodronate (200 μL/souris) quotidiennement pendant 3 jours avant l'expérience puis tous les 3 jours pendant cette expérience comme décrit précédemment dans la réf. 90. Toutes les autres étapes expérimentales et la collecte d'échantillons étaient compatibles avec le cinquième essai sur les animaux. Cette expérience a également été divisée en trois groupes : (1) groupe CON-E (n = 6) ; (2) groupe ETEC K88-E (n = 6) ; et (3) groupe ETEC K88 + LmEVs-E (n = 6).

L'ADN génomique total des échantillons fécaux a été extrait à l'aide du kit QIAamp Fast DNA Stool Mini (Qiagen, Tübingen, Allemagne). La concentration et la qualité de l'ADN ont été mesurées avec un fluoromètre Qubit 2.0 (Life Technologies, CA, USA). De l'ADN de haute qualité (1 μg) a été utilisé comme matériau d'entrée pour la construction de la bibliothèque. Les bibliothèques de séquençage ont été générées à l'aide du kit de préparation de bibliothèque d'ADN NEBNext® Ultra™ pour Illumina (NEB, USA). La bibliothèque a été séquencée à l'aide d'une plate-forme Illumina HiSeq et des lectures appariées ont été générées.

Des lectures de haute qualité ont été obtenues pour l'analyse en aval en filtrant les adaptateurs, les lectures de faible qualité et la contamination de l'ADN génomique de l'hôte à partir des données de séquençage brutes. L'annotation de la taxonomie a été réalisée avec MetaPhlAn3 (version 3.0.7)91 et leur abondance relative a été calculée, suivie du calcul des espèces différentielles entre les porcelets diarrhéiques et les porcelets sains à l'aide de la méthode Linear discriminant analysis Effect Size (LEfSe), avec un critère de dépistage du score d'analyse discriminante linéaire (LDA) ≥ 2 et P < 0,05. Les packages R vegan (version 2.5-7) et ade4 (version 1.7-18) ont été utilisés pour calculer la diversité alpha et effectuer des analyses PCoA. La différence de diversité alpha entre les deux groupes a été calculée à l'aide de Wilcox.test. La signification de PCoA a été calculée à l'aide d'une analyse de variance multivariée permutationnelle (PERMANOVA) basée sur 9999 permutations. Les espèces dont l'abondance relative moyenne était inférieure à 0,1 % ont été filtrées et les espèces restantes ont été utilisées comme caractéristique d'entrée pour le modèle de classification aléatoire des forêts avec les packages R forcats (version 0.5.1), random Forest (version 4.7-1) et splines (version 4.1.2). L'importance des espèces a été classée par la diminution moyenne de la précision du modèle. Les 20 principales espèces ont été sélectionnées comme variables dans le modèle forestier aléatoire, et leurs valeurs d'aire sous la courbe (AUC) ont été calculées avec le package R ROCR (version 1.0-11) pour évaluer la précision du modèle. De plus, humann3 (version 3.0.0) a été utilisé pour effectuer une annotation fonctionnelle. Le KO différentiel significatif a été calculé par Wilcox.test. Les KO significativement différentiels (p_adj <0, 01) ont été enrichis contre les voies KEGG à l'aide du package R MicrobiomeProfiler (version 1.1.3).

La région V3-V4 du gène de l'ARNr 16S a été amplifiée à l'aide d'amorces universelles, et les produits amplifiés ont été regroupés en quantités équimolaires et séquencés sur la plateforme Illumina MiSeq pour générer des lectures appariées de 300 pb. Les lectures brutes sans code-barres ont été soumises à un contrôle de qualité en filtrant les lectures de mauvaise qualité. Les lectures de haute qualité résultantes ont été importées dans QIIME2 en entrée. En bref, des séquences de haute qualité ont d'abord été débruitées à l'aide de l'algorithme DADA2 et soumises à une classification taxonomique à l'aide de la base de données SILVA 132. L'analyse des données a été effectuée sur la plateforme en ligne gratuite de Majorbio Cloud Platform (www.majorbio.com). Les résultats microbiens ont été ajustés par l'analyse du taux de fausses découvertes (FDR) (q < 0,05). La signification statistique a été considérée à P < 0,05.

Le réactif Trizol (Invitrogen) a été utilisé pour extraire l'ARN total. L'ARN obtenu a été mesuré à l'aide du spectrophotomètre NanoDrop ND-1000 (Thermo, USA). La préparation et le séquençage de la bibliothèque de transcriptomes ont suivi92. La qualité des lectures appariées brutes a été contrôlée et ajustée par SeqPrep (https://github.com/jstjohn/SeqPrep) et Sickle (https://github.com/najoshi/sickle) en utilisant les paramètres par défaut. Les lectures propres obtenues ont été comparées au génome de référence de souris (http://asia.ensembl.org/Mus_musculus/Info/Index) par TopHat (version 2.0.0) pour obtenir des fichiers d'abondance de gènes. Pour obtenir des gènes différentiellement exprimés entre les deux groupes, une analyse d'expression différentielle a été réalisée par le package R DESeq2 avec un seuil de dépistage de |log2FoldChange| ≥ 1 et padjust < 0,05. Après cela, une analyse d'enrichissement KEGG a été effectuée pour les gènes exprimés de manière différentielle avec une valeur P corrigée de Bonferroni ≤ 0, 05 était nécessaire pour filtrer les voies significativement enrichies. L'analyse de la voie KEGG a été réalisée par KOBAS (http://kobas.cbi.pku.edu.cn/home.do).

Nous avons effectué la détection et l'analyse métabolomique par Metabo-Profile (Shanghai, Chine), puis quantifié tous les métabolites ciblés avec Metabo-Profile Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd93.

Des tests de coloration H&E, PAS et AB ont été effectués94,95. En bref, des tissus intestinaux fixés avec du formaldéhyde à 4 % ont été inclus dans de la paraffine, et des coupes (épaisseur de 5 mm) ont été obtenues et colorées avec H&E, PAS ou AB. Le logiciel CaseViewer (version 220 2.2) a été utilisé pour mesurer la hauteur des villosités, la profondeur des cryptes et le nombre de cellules caliciformes et de glycoprotéines et pour évaluer le score histopathologique.

La teneur en IL-1β, IL-6, IL-8, TNF-α, LPS, D-LA et DAO dans le sérum, l'iléon et les tissus du côlon de souris a été mesurée à l'aide de kits de dosage immuno-enzymatique (ELISA) conformément avec les instructions du fabricant (Shanghai Enzyme-linked Biotechnology Co. Ltd., Shanghai, Chine).

La solution de lyse des protéines RIPA (Roche, Penz-berg, Allemagne) et les kits de dosage des protéines BCA (Pierce, Rockford, IL, USA) ont été utilisés pour extraire et quantifier les protéines des tissus intestinaux, respectivement. Les protéines séparées par électrophorèse sur gel SDS-PAGE ont été transférées sur une membrane de nitrocellulose (Bio Trace, Pall Co, USA). Ensuite, la membrane de nitrocellulose a été immergée dans un tampon de blocage pendant 2 h puis incubée avec les anticorps primaires correspondants pendant une nuit. Les membranes ont été lavées avec une solution saline tamponnée au Tris avec du Tween (TBST) puis immergées dans une dilution d'anticorps secondaire pendant 2 h. Enfin, l'expression de la protéine a été enregistrée et analysée à l'aide d'un système d'imagerie (Bio-Rad, USA) et du logiciel Quantity One (Bio-Rad, USA), respectivement. Les anticorps suivants utilisés dans les tests de Western blot ont été présentés comme suit : anticorps secondaires conjugués à la peroxydase de raifort (HRP) (Santa Cruz Biotechnology, chèvre anti-lapin (sc-2004 ; 1:10 000), chèvre anti-souris (sc-2005 ; 1:10 000)), anticorps ZO-1 (Abcam, ab221547; 1:1000), anticorps Occludin (Abcam, ab216327; 1:1000), anticorps phospho-AKT (Abcam, ab8933; 1:1000), anticorps AKT ( Abcam, ab8805; 1:1000), anticorps phospho-NF-κB (Abcam, ab239882; 1:1000), anticorps NF-κB (Abcam, ab207297; 1:1000), anticorps iNOS (Abcam, ab178945; 1:1000) , anticorps Arg1 (Abcam, ab92274; 1:1000), anticorps β-actine (Sigma-Aldrich, A5441; 1:1000). Tous les blots ou gels proviennent de la même expérience et ont été traités en parallèle. Les transferts originaux sont fournis dans les informations supplémentaires.

La signification statistique a été évaluée à l'aide d'une analyse de variance unidirectionnelle (ANOVA), suivie d'un test LSD post hoc pour les comparaisons par paires (SPSS version 20.0 pour Windows ; SPSS Inc., Chicago, IL, États-Unis). Tous les résultats ont été exprimés en moyenne ± SEM. Les différences étaient considérées comme statistiquement significatives si P < 0,05. Le nombre de répétitions utilisées pour les statistiques est indiqué dans les légendes des figures.

Les ensembles de données à l'appui des conclusions de cet article sont disponibles dans le référentiel NCBI Sequence Read Archive (SRA) sous les numéros d'accession PRJNA847006, PRJNA847017 et PRJNA895872.

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Ce travail a été soutenu par la Fondation nationale des sciences de la nature de Chine (32272898 et 31902189), la Fondation des sciences naturelles de la province du Hubei (2021CFB436 et 2021CFA018), le programme d'innovation des connaissances du projet Wuhan-Shuguang (2022020801020230), et les fonds de recherche fondamentale pour les universités centrales (2662020DKQD004). Nous remercions le Dr Canfeng Hua, Université de Yale, pour ses commentaires utiles concernant le manuscrit.

Ces auteurs ont contribué à parts égales : Jingjing Li, Shuaifei Feng, Zhenyu Wang.

Collège des sciences et technologies animales, Université agricole de Huazhong, Wuhan, 430070, Chine

Jingjing Li, Shuaifei Feng, Jinhui He, Zeyue Zhang, Huicong Zou, Zhifeng Wu, Xiangdong Liu, Hong Wei et Shiyu Tao

State Key Laboratory of Animal Nutrition, College of Animal Science and Technology, China Agricultural University, No. 2 Yuanmingyuan West Road, Beijing, 100193, Chine

Zhenyu Wang

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ST, XL et HW ont conçu la recherche. Les expériences ont été réalisées principalement par JL, SF et ZW, et certaines expériences ont été réalisées avec l'aide de ZW, JH et ZZ, SF et HZ ont analysé les données. ST a rédigé le manuscrit avec l'aide de tous les auteurs. Tous les auteurs ont lu et approuvé la version finale du manuscrit. JL, SF et ZW ont contribué à parts égales à cette étude.

Correspondance avec Xiangdong Liu, Hong Wei ou Shiyu Tao.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

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Réimpressions et autorisations

Li, J., Feng, S., Wang, Z. et al. Les vésicules extracellulaires dérivées de Limosilactobacillus mucosae modulent le phénotype des macrophages et orchestrent l'homéostasie intestinale dans un modèle de porcelet diarrhéique. npj Biofilms Microbiomes 9, 33 (2023). https://doi.org/10.1038/s41522-023-00403-6

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Reçu : 03 janvier 2023

Accepté : 22 mai 2023

Publié: 06 juin 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s41522-023-00403-6

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