L'altération de la phosphorylation de la tyrosine du protéome cardiaque et de la voie EGFR contribue à la cardiomyopathie hypertrophique

Biologie des communications volume 5, Numéro d'article : 1251 (2022) Citer cet article

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Les altérations de la phosphorylation de la sérine/thréonine du protéome cardiaque sont une caractéristique de l'insuffisance cardiaque. Cependant, la contribution de la phosphorylation de la tyrosine (pTyr) à la pathogenèse de l'hypertrophie cardiaque reste incertaine. Nous utilisons la cartographie globale pour découvrir et quantifier pTyr spécifique au site dans deux modèles de souris hypertrophiques cardiaques, à savoir la surexpression cardiaque de ErbB2 (TgErbB2) et de la chaîne lourde de myosine α R403Q (R403Q-αMyHC Tg), par rapport aux cœurs témoins. À partir de là, il existe des altérations phosphoprotéomiques importantes chez les souris TgErbB2 dans les voies de cardiomyopathie ventriculaire droite, de cardiomyopathie hypertrophique (HCM) et de cardiomyopathie dilatée (DCM). D'autre part, les souris R403Q-αMyHC Tg ont indiqué que la voie EGFR1 est centrale pour l'hypertrophie cardiaque, ainsi que l'activation des voies de signalisation de l'angiopoïétine, de l'ErbB, de l'hormone de croissance et des chimiokines. Étonnamment, la plupart des protéines de myofilament ont une régulation négative de pTyr plutôt qu'une régulation positive. L'analyse d'enrichissement en substrat kinase (KSEA) montre une régulation négative marquée de l'activité de la voie MAPK en aval de k-Ras chez les souris TgErbB2 et l'activation des voies EGFR, adhésion focale, PDGFR et actine du cytosquelette. L'inhibition in vivo d'ErbB2 par AG-825 diminue le désordre des cardiomyocytes. Le phosphoprotéome sérine/thréonine et tyrosine confirme les voies décrites ci-dessus et l'efficacité du traitement AG-825. Ainsi, pTyr altéré peut jouer un rôle régulateur dans les modèles d'hypertrophie cardiaque.

La cardiomyopathie hypertrophique familiale (CMH) augmente l'épaisseur de la paroi du ventricule gauche (VG) ; des conditions de chargement anormales ne peuvent expliquer cette altération. Les mutations dans les gènes codant pour les protéines du sarcomère sont courantes chez les patients atteints de CMH (40 à 60 %)1. L'étude des modifications post-traductionnelles (PTM) des protéines du sarcomère (ou protéines de gestion du Ca2+) peut offrir une opportunité unique de mieux comprendre comment les troubles génétiques conduisent au dysfonctionnement cardiaque et de découvrir des cibles potentielles pour la thérapie2,3,4. Par exemple, les PTM de la troponine I cardiaque (cTnI), une protéine de sarcomère impliquée de manière centrale dans la régulation de la contractilité myocardique, ont été largement étudiées, en particulier pour le rôle fonctionnel de la phosphorylation dépendante de la protéine kinase A5. Notamment, la phosphorylation de cTnI-S22/23, l'un des sites régulateurs les plus pertinents de cTnI, est régulée négativement dans l'insuffisance cardiaque humaine (IC)6 et conduit à un dysfonctionnement contractile7.

La phosphorylation de la tyrosine (pTyr) est essentielle au développement structurel cardiaque et à l'organisation des myofibrilles au cours de l'embryogenèse8,9. Par exemple, plusieurs tyrosine phosphatases ont été liées aux maladies cardiaques et ont même été proposées comme cible thérapeutique pour certaines affections. De plus, des mutations du non-récepteur de la tyrosine-protéine phosphatase de type 11 (PTPN11) peuvent entraîner une HCM ou une cardiomyopathie dilatée (DCM)10,11. Dans le cœur, PTPN11 joue probablement un rôle dans le dysfonctionnement systolique produit par la surcharge de pression12. La phosphatase acide 1 (ACP1) est une autre tyrosine phosphatase associée à la physiopathologie cardiaque. En conséquence, sa suppression protège contre la cardiomyopathie induite par le stress13. Notre groupe a d'abord montré que la phosphorylation de cTnI-Y26 est facilement détectée dans les cœurs humains sains et régulée à la baisse dans l'HF et le DCM14 humains. Cependant, la façon dont ces altérations contribuent à l'apparition et à la progression de la maladie cardiaque reste mal comprise. Une meilleure compréhension des modifications supplémentaires spécifiques au site des sites individuels phosphorylés par la tyrosine aiderait considérablement dans cette direction.

La présente étude a appliqué une approche protéomique globale quantitative de la phosphotyrosine sans étiquette et en tandem avec marquage de masse (TMT) pour déterminer quels sites de sarcomère ont modifié les quantités de phosphorylation de Tyr à des sites spécifiques dans deux modèles non apparentés de HCM. Le premier modèle est secondaire à la surexpression du récepteur tyrosine kinase ErbB215,16. La seconde récapitule les caractéristiques de la maladie humaine, plus précisément une mutation R403Q de la chaîne lourde de la myosine, une protéine du myofilament, distinctive de la HCM17 familiale. Les souris TgErbB2 développent initialement une hypertrophie cardiaque concentrique frappante, qui évolue vers une fibrose diffuse et un désordre myocytaire16 avec HCM. Cette lignée de souris a également une manipulation anormale du calcium, est sujette aux arythmies et au développement d'une cardiomyopathie obstructive hypertrophique2. De même, les souris R403Q-αMyHC reproduisent la HCM familiale humaine en passant d'une hypertrophie et d'une fibrose légères à un désordre manifeste des myocytes, à une IC et à des arythmies17.

L'impulsion principale derrière cette étude était de déterminer si le déclenchement de la HCM par différents mécanismes suscite des voies/sites de régulation similaires liés à pTyr dans le cœur. Ce faisant, la manipulation de ces sites pTyr offrirait à son tour de nouvelles opportunités de ciblage thérapeutique dans différentes formes de CMH humaine.

Tout d'abord, nous avons effectué une analyse par immunoblot du myocarde de souris TgErbB2, R403Q-αMyHC et non transgéniques (Ntg) pour estimer pTyr. Il y a eu une baisse globale de pTyr dans les homogénats de cœur entier de souris TgErbB2 (p = 0, 0298) et R403Q-αMyHC ( p = 0, 003) par rapport à Ntg (Fig. 1a, b). Le signal pTyr a été normalisé aux niveaux d'expression de la troponine I (Fig. 1a). Bien que la proto-oncogène tyrosine-protéine kinase Src (c-Src) soit en aval de la signalisation ErbB2, nous n'avions pas anticipé son expression accrue chez les souris R403Q-αMyHC (Fig. 1c, d, p = 0,0414) lorsqu'elle est normalisée aux signaux de transfert Western GAPDH . L'activité c-Src (phosphorylation de c-Src Tyr416) ​​semblait être améliorée chez les souris R403Q-αMyHC par rapport à Ntg; cependant, il n'a pas atteint la signification statistique (Fig. 1e, f, une ANOVA à une voie a été utilisée pour comparer les groupes). Au total, ces données suggèrent que pTyr est un PTM largement distribué dans le myocarde. Par conséquent, sa régulation positive ou négative peut jouer un rôle régulateur dans la progression de la maladie des cardiomyopathies non ischémiques, comme dans le cas de la cardiomyopathie familiale (HCM) et du DCM, dans le cadre de la réponse physiopathologique à la maladie sous-jacente.

a Western Blots montre une diminution de pTyr sur des souris TgErbB2 (p = 0,0298) et des homogénats cardiaques R403Q-α-MyHC (p = 0,003). Le signal de la troponine I montre la charge protéique totale correspondante. b L'analyse densitométrie montre qu'après la normalisation du signal pTyrosine au cTnI total, les souris TgErbB2 et R403Q-α-MyHC ont considérablement diminué en pTyr. c Western Blots montre les niveaux d'expression de Src total et p-Src (Tyr 416) et GAPDH comme contrôle de chargement. d L'analyse de densitométrie a révélé que les niveaux de Src sont significativement élevés dans R403Q-α-MyHC (p = 0, 0282), alors que e et f montrent que les niveaux de phosphorylation de p-Src sont élevés dans R403Q-α-MyHC mais n'ont pas atteint la signification statistique. Les signaux en d et e ont été normalisés à la GAPDH totale, tandis que dans f pSRC a été normalisé à la SRC totale. Ntg (n = 3), TgErbB2 (n = 3) et R403Q-α-MyHC (n = 3), les barres d'erreur représentent SEM Une ANOVA à une voie a été utilisée pour comparer les groupes.

Ensuite, nous avons adopté une approche protéomique globale de la phospho-tyrosine TMT pour comparer le profil pTyr du cœur entier des souris Ntg, TgErbB2 et R403Q-αMyHC (Fig. 2). Nous avons émis l'hypothèse qu'un profilage global non biaisé de pTyr du cœur entier fournirait un paysage complet sur les sites de tyrosine spécifiques dans les protéines essentielles spécifiques au cœur et les tyrosine kinases, fournissant ainsi des indices sur les tyrosine kinases médiatrices de pTyr cardiaque. Un total de 1 800 spectres de peptides appariés (PSM) ont été collectés à partir du protéome entier du ventricule cardiaque, et 50 % ont été identifiés avec une grande confiance, ce qui a donné 213 (R403Q-αMyHC), 214 (Ntg), 217 (TgErbB2) peptides uniques phosphorylés à la tyrosine correspondant à 499 protéines (Fig. 2g). Les tableaux avec toutes les phosphoprotéines et phosphopeptides identifiés sont fournis dans les données supplémentaires 3. La qualité, l'intensité et la distribution des données de spectrométrie de masse après la normalisation du balayage médian sont incluses dans les Fig. 1a, b supplémentaires. La confiance dans la localisation du site phosphorylé a été évaluée pour l'annotation, et un score de plus de 49 % était requis. Cet ensemble de données indique qu'un rendement comparable d'identification des peptides a été atteint, une reproductibilité sur l'enrichissement des peptides pTyr et des données MS/MS de haute qualité en utilisant des approches similaires à d'autres18,19,20.

a Les tissus ventriculaires ont été rincés avec du PBS et soumis à une stabilisation thermique à l'aide d'un stabilisateur de tissu T1 pour maximiser la préservation de la phosphorylation, puis congelés instantanément dans de l'azote liquide et stockés à -80 ° C jusqu'à une utilisation ultérieure. b Des cœurs de souris Ntg, TgErbB2 et R403Q-αMyHC (n = 5 par groupe) ont été traités en parallèle pour obtenir des lysats de cœur entier; 30 mg de lysats de protéines de chaque cœur de souris ont été utilisés pour la digestion de la trypsine en solution, un total de 150 mg de protéines trypsinisées par génotype ont été dessalés en C18 et lyophilisés à -20 ° C pendant trois jours. c Un total de 150 mg de peptides trypsiques (matériel regroupé de 5 cœurs par groupe) ont été enrichis en pTyrosine en utilisant une précipitation par immunoaffinité (perles d'agarose protéique + 300 microgrammes de mAb anti-pTyr) et dessalés sur des pointes de stade C18. d La RP-HPLC ESI (ionisation par électrospray) MS/MS a été réalisée sur un LTQ Orbitrap Elite (Thermo Scientific) pendant 120 min sur un gradient linéaire d'acétonitrile (4 à 40 %). Les données brutes ont été recherchées avec Mascot 2.3 et une quantification sans étiquette avec des chromatogrammes d'ions extraits MS1 a été effectuée à l'aide de MaxQuant. Cette approche a été répétée trois fois avec des échantillons des trois groupes en parallèle ; 15 cœurs par génotype en trois répétitions techniques. e Une fraction du flux d'enrichissement en pTyr a été utilisée pour un 9-plexTMT ; trois répliques de chaque génotype (Ntg, TgErbB2 et R403Q-αMyHC) ont été regroupées, fractionnées en RPLC pour une quantification complète du protéome, f Les données de pTyrosine et Full Proteome ont été traitées de la même manière, les signaux de pTyrosine ont été normalisés pour correspondre à l'expression totale de la protéine pour normaliser les données. Les analyses sont détaillées dans le texte et les données supplémentaires. g montre le chevauchement des protéines phosphorylées trouvées dans les trois groupes, tandis que h montre les peptides tyrosine-phosphorylés qui se chevauchent parmi les trois groupes.

L'approche protéomique globale de la phospho-tyrosine TMT a identifié 499 protéines phosphorylées sur tyrosine différentes, 294 protéines phosphorylées sur tyrosine qui se chevauchent parmi les Ntg et le myocarde à partir de deux modèles hypertrophiques cardiaques (TgErbB2 et R403Q-αMyHC). Au niveau peptidique, 217 sites pTyr ont été détectés avec un chevauchement de 178 résidus tyrosine-phosphorylés (Fig. 2g, h).

Ensuite, l'accent a été mis sur les protéines cardiaques spécifiques de l'appareil myofilament. Neuf protéines majeures du myofilament étaient phosphorylées sur tyrosine. Ils abritent plusieurs sites d'acides aminés pTyr, dont beaucoup sont nouveaux (voir la Fig. 2 supplémentaire); le meilleur exemple est Titin, avec 36 sites d'acides aminés pTyr (voir Fig. 3 supplémentaire). En outre, dix-sept tyrosine kinases avaient des peptides tyrosine-phosphorylés détectables ; ainsi, ils pourraient potentiellement être impliqués dans la régulation du myofilament cardiaque pTyr.

En revanche, seules deux tyrosine phosphatases (Ptpn11 et Ptpra) avaient des peptides tyrosine-phosphorylés détectables ; par conséquent, ils sont susceptibles de jouer un rôle dans la régulation des niveaux cardiaques de pTyr dans le sarcomère. En plus du nombre de tyrosine kinases trouvées avec des peptides phosphorylés, quinze sérine/thréonine kinases avaient des peptides tyrosine-phosphorylés détectables ; cependant, une seule sérine/thréonine phosphatase (Ppp1r12b) a démontré des peptides tyrosine-phosphorylés. Ces données montrent que pTyr est largement distribué dans le protéome cardiaque (sarcomère cardiaque et autres sous-protéomes) et qu'une interférence entre les tyrosine kinases/phosphatases et les sérine/thréonine kinases/phosphatases pourrait réguler le sarcomère cardiaque pTyr.

Ensuite, nous avons entrepris des analyses bioinformatiques pour définir l'impact de la surexpression cardiaque de ErbB2 et de la mutation R403Q de la chaîne lourde de la myosine cardiaque sur les modifications spécifiques de pTyr. Nous avons déterminé les voies de transduction de signalisation associées à deux types non apparentés de HCM. La normalisation du signal spectral de pTyr a été effectuée sur l'ensemble des sondes isobares TMT cardiaques globales qui quantifiaient le protéome complet (Fig. 2e, f), et des méthodes statistiques ont été appliquées, comme décrit précédemment21,22. Ensuite, une analyse en composantes principales (ACP) et une classification hiérarchique ont été appliquées pour déterminer si les profils pTyr étaient similaires au sein des groupes. Cette approche a révélé que les trois groupes se séparent par composant principal 1 (PC1 = 46%) dans la quantification complète du protéome (Fig. 3a). Cette découverte était également évidente après la normalisation de pTyr au protéome complet ; les trois groupes se séparent le long de la composante principale (PC1 = 52,2 %) (Fig. 3b). Il convient de noter qu'un réplicat technique/biologique de R403Q-αMyHC a été supprimé car il avait plus de 50 % de peptides pTyr absents par rapport aux deux autres réplicats. Par conséquent, cela a été considéré comme une défaillance technique. Les cartes thermiques de peptides pTyr normalisés régulés à la hausse ou à la baisse ont permis de visualiser la reproductibilité technique et la spécificité de la manière dont le génotype de l'hypertrophie cardiaque a largement influencé le remodelage du protéome pTyr (Fig. 3c, p <0, 05 par ANOVA). Les peptides tyrosine-phosphorylés sont codés par couleur en fonction de leurs intensités de signal extraites du chromatogramme MS1 normalisées par rapport à l'intensité MS2 du peptide marqueur isobare TMT. Le jaune est régulé positivement et le bleu est régulé négativement. Cette approche nous a fourni l'abondance globale du peptide tyrosine du protéome cardiaque. Ces résultats démontrent que les souris Ntg, TgErbB2 et R403Q-αMyHC ont un protéome pTyr avec une signature distincte, mise en évidence par PCA et des cartes thermiques regroupées dans des méthodes statistiques non biaisées et non supervisées.

une PCA non supervisée du protéome cardiaque complet des souris non transgéniques, TgErbB2 et R403Q-αMyHC montre une ségrégation distincte des groupes expérimentaux. Les groupes se séparent avec la première composante principale (PC #1), qui représente 46 % de la corrélation totale dans l'expression du protéome complet (normalisée, moyenne = 0, variance = 1). b PCA non supervisée du signal des peptides pTyrosine normalisé à l'expression complète du protéome. Les groupes se séparent également avec la première composante principale (PC #1), représentant 52,2 % de la corrélation totale. c Une carte thermique a été utilisée pour visualiser le regroupement hiérarchique non supervisé des peptides pTyrosine normalisés à l'expression complète du protéome avec une valeur p <0, 05 par ANOVA. Surreprésenté (jaune) et sous-représenté (bleu). d Diagramme volcanique montrant le changement de pli Log2 et la valeur p -Log10 de chaque peptide pTyr dans la comparaison par paires de Ntg et TgErbB2. Les points de données surlignés en rouge montrent une intensité significativement plus faible, tandis que les données en vert montrent une intensité significativement plus élevée. Les sites significatifs ont été agrandis sur la figure (carrés en pointillés) pour marquer certains sites peptidiques. Les points de données magenta correspondent aux gènes significativement associés aux voies de la maladie MsigDB. Le point de données cyan n'a pas atteint la signification statistique bien qu'il indique la voie EGFR1. e Parcelle Volcano montrant le changement de pli Log2 et la valeur p -Log10 de chaque peptide pTyr dans la comparaison par paires de Ntg et R403Q-αMyHC. Les points de données rouges et verts ont été codés par couleur comme ci-dessus. Avec un grossissement similaire à celui ci-dessus, les points de données cyan montrent une association significative avec la voie EGFR1 par PTMsigDB. f Molecular Signature DB (MSigDB) et Molecular PTMs Signature DB (PTMsigDB) des données Global pTyr ont identifié des voies qui ont été considérablement modifiées.

Des changements statistiquement significatifs (changement de facteur Log2> 1, -Log valeur p <1, 3) ont été détectés dans 23 phosphosites correspondant à 18 protéines chez les souris TgErbB2 (Fig. 3d) et 45 phosphosites dans 35 protéines chez les souris R403Q-αMyHC Tg (Fig. .3f) en utilisant ANOVA (p < 0,05). Il est à noter que pTyr de plusieurs peptides de la chaîne lourde alpha-myosine (Myh7-Y386, Y410, Y1375), un peptide de la chaîne lourde bêta-myosine (Myh6-Y1349), et deux peptides de Titine (Ttn-Y2118, Y21190) sont régulés à la baisse tandis que le Ttn cardiaque Y-31324 pTyr est régulé à la hausse sur les cœurs de souris TgErbB2 (Fig. 3d). Fait intéressant, la phosphorylation de Myh7-Y410 est régulée à la baisse dans TgErbB2 et régulée à la hausse dans les cœurs de souris R403Q-αMyHC Tg (Fig. 3e). En revanche, cTnI Y113 (Tnni3-Y113) pTyr est régulé à la baisse dans les deux modèles HCM mais n'a atteint une signification statistique que dans les cœurs de souris R403Q-αMyHC Tg. La phosphorylation de la titine (TtnY1881, Y1901 et Y33864) était significativement régulée à la baisse dans ce dernier modèle.

Nous avons utilisé MATLAB, un logiciel PhoshoEnrichment sur mesure (M. Ayati), qui intègre la base de données de signatures moléculaires (MsigDB)23 et une nouvelle base de données de signatures de phosphorylation spécifiques au site PTM des kinases, des perturbations et des voies de signalisation (PTMsigDB)24. Le Broad Institute a créé les bases de données, qui comprennent une collection bien organisée d'ensembles de données génétiques annotées et de PTM. PTMsigDB tient compte des changements spécifiques au site phospho et de leur impact sur l'activation ou l'inhibition d'une voie donnée, ainsi que des perturbations de la biologie des systèmes expérimentaux les plus courantes. L'avantage de ces outils bioinformatiques est d'évaluer la signification statistique de chaque voie et perturbation (niveau gène et niveau site) à l'aide d'un test hypergéométrique. Ici, le nombre de phosphosites et de gènes identifiés est utilisé comme population pour le paramètre de modèle hypergéométrique au lieu de tous les gènes connus.

Une analyse d'enrichissement des voies a été effectuée sur des gènes/sites significatifs en utilisant un niveau gène-protéine avec MSigDB. Les voies importantes des souris TgErbB2 sont la cardiomyopathie ventriculaire droite arythmogène (CVDA), HCM, DCM et la signalisation Integrin AlphaIIB Beta3 (Fig. 3f). Les voies les plus importantes de R403Q-αMyHC Tg sont la voie du récepteur de l'angiopoïétine, la voie de signalisation ErbB, la voie de signalisation du récepteur de l'hormone de croissance et la voie de signalisation des chimiokines (Fig. 3f).

Les deux modèles animaux Tg ont montré une altération remarquable de la plakophiline-2 (PKP2) pTyr au site Y119, bien que dans les cœurs TgErbB2, elle ait été régulée à la baisse et dans les cœurs R403Q-αMyHC Tg, elle ait été régulée à la hausse (Fig. 3e). L'analyse MsigDB du flux global de TMT du cœur entier à travers le protéome entier est affichée dans les données supplémentaires 3. PKP2 est un composant essentiel des desmosomes du myocarde. Des mutations dans ce gène sont associées à une cardiomyopathie arythmogène25,26,27. Par conséquent, la phosphorylation perturbée de Plakophilin-2 pourrait avoir un impact fonctionnel.

En comparaison, le PTMsigDB a révélé que l'analyse de la voie au niveau spécifique du site phosphorylé n'a pas atteint la signification statistique pour la voie EGFR1 chez les souris TgErbB2 ; seuls deux phosphosites spécifiques au site correspondaient à la voie EGFR1 ; ils sont surlignés en couleur cyan sur le graphique Volcano (Fig. 3d) et la table PTMsigDB (Fig. 3f). Curieusement, chez les souris R403Q-αMyHC, la même voie était statistiquement significative ; voir les dix changements spécifiques au site qui correspondaient à la voie EGFR1 (p = 0,001) représentés dans le diagramme du volcan sous forme de points de données cyan (Fig. 3e) et le tableau PTMsigDB (Fig. 3f). Ces données montrent l'utilité des bases de données spécifiques au site de phosphorylation pour affiner la recherche d'une voie biologiquement pertinente sur les ensembles de données phosphoprotéomiques, en particulier dans les événements de phosphorylation sous-étudiés tels que pTyr avec de petits ensembles de données à ce jour.

Nous avons utilisé une protéomique d'étiquetage quantitatif TMT pour obtenir un aperçu plus précis des changements de pTyr du myofilament. Plus précisément, nous avons émis l'hypothèse que l'enrichissement des myofilaments augmenterait le nombre d'identifications de sites dans les protéines des myofilaments, en particulier celles présentant des modifications de phospho-tyrosine à faible abondance qui auraient pu être manquées en utilisant l'approche globale. À cette fin, nous avons utilisé des myofilaments fraîchement isolés de souris Ntg et TgErbB2, comme décrit dans "Methods" 28, avec des modifications mineures. Nous avons utilisé trois cœurs par génotype pour caractériser le protéome du myofilament pTyr (Fig. 4a, b), comme décrit pour le phosphoprotéome de l'insuffisance cardiaque20. En bref, nous avons réalisé une expérience TMT à 6 plex à grande échelle dans laquelle la plupart des peptides marqués au TMT étaient enrichis en pTyr (Fig. 4c). Nous avons adopté un flux de travail similaire à la protéomique phospho-tyrosine TMT du cœur entier pour une analyse plus approfondie des données statistiques (Fig. 4d). Les peptides identifiés avec des spectres uniques ont été supprimés, ce qui a conduit à 24 727 PSM. Après normalisation par balayage médian, 1116 peptides correspondaient à 1092 protéines. Voir les Fig. 4a, b supplémentaires pour la distribution d'intensité spectrale avant et après la normalisation (Fig. 4c, d supplémentaires). Pour le protéome pTyr, 4391 PSM ont été collectés et ont suivi la même curation de contrôle de qualité de l'ensemble du protéome pour supprimer les données manquantes et les spectres uniques, ce qui a conduit à 3064 PSM. Les données brutes de la distribution de l'intensité spectrale du protéome pTyr sont présentées avant normalisation (Fig. 5a, b supplémentaires) et après normalisation (Fig. 5c, d supplémentaires) et PCA (Fig. 5b). Après normalisation par balayage médian, 832 peptides correspondaient à 184 protéines différentes. Le pTyr spécifique pour 146 peptides a été quantifié car ils avaient des peptides correspondants à partir des données d'expression du protéome complet.

un myofilament de cœurs de souris transgéniques Ntg (n = 3) et ErbB2 (n = 3) a été fraîchement isolé sur des tampons glacés contenant des cocktails d'inhibiteurs de protéinase et de phosphatase (Roche). b Tout le matériel a été remis en suspension dans du TEAB, puis réduit et alkylé. Les peptides tryptiques ont été dessalés et marqués avec des étiquettes de masse en tandem isobares 6-plex (TMT). c Les peptides digérés et marqués ont été regroupés et dessalés avec C18 SEP-PAK. L'enrichissement en phosphotyrosine a été réalisé avec le kit PTMScan Phospho-Tyrosine Rabbit mAb (P-Tyr-1000) (Cell Signaling Technology). Les échantillons de peptides élués ont été dessalés à l'aide des pointes C18 STAGE d'un système de chromatographie liquide à nanoflux Easy-nanoLC 1200 couplé à Orbitrap Fusion Lumos Tribrid.

un protéome complet a été marqué au TMT, et les intensités de signal protéique enregistrées et résumées indiquent que les groupes expérimentaux se séparent avec le premier composant principal (PC # 1), qui représente 53, 9% de la corrélation totale dans le protéome d'expression (normalisé, moyen = 0, écart = 1). b PCA du phospho-Tyr Proteome révèle une tendance similaire et les groupes se séparent le long du PC # 1, ce qui représente 47,2% de la corrélation. c Les intensités de signal du protéome phospho-Tyr ont été normalisées par rapport à l'expression de la protéine Full Proteome et analysées par analyse en composantes principales. La signature distinctive de pTyr est encore apparente par PC#1 et représente 57% de la corrélation. d Une carte thermique a été utilisée pour visualiser le regroupement de corrélation hiérarchique non supervisé de l'expression des protéines et de l'expression du protéome e pTyr avec p <0, 05 par comparaison du test t à 2 échantillons modéré par LIMMA des groupes TgErbB2 et Ntg. f Parcelle volcanique montrant le changement de pli Log2 et la valeur p -Log10 de chaque peptide pTyr dans la comparaison par paires de Ntg et TgErbB2. Les points de données en rouge ont montré une intensité significativement plus faible, tandis que les points de données en vert ont montré une intensité significativement plus élevée. Pour la clarté de la présentation, seuls certains peptides ont été mis en évidence. g Molecular Signature DataBase (MSigDB) a confirmé les cibles et l'implication des voies dilatées et HCM KEEG également trouvées sur les souris TgErbB2 à la Fig. 3.

La première étape de l'analyse utilise l'ACP non supervisée et le regroupement hiérarchique. L'analyse PCA a montré la corrélation entre les membres du même groupe (Fig. 5a – c), le protéome complet, le protéome pTyr et le protéome pTyr normalisé se séparent bien le long de PC1, montrant une corrélation d'expression de 57,6%, 82,4% et 62,1%, respectivement. Les cartes thermiques de l'expression hiérarchiquement regroupée ont permis de visualiser comment la surexpression cardiaque de TgErbB2 a largement influencé le regroupement des génotypes. Les deux modèles, les protéines de l'ensemble du protéome (Fig. 5d) et l'intensité normalisée du protéome pTyr (Fig. 5e), ont suggéré un remodelage en miroir (377 protéines pour l'ensemble du protéome et 51 peptides pTyr avaient ap <0,05 par LIMMA modéré 2- exemple de comparaison de test t).

Le protéome complet a détecté 1116 peptides qui correspondaient à 1092 protéines. Une comparaison du changement de pli Log2 (FC) de Ntg/TgErbB2 a montré 377 protéines avec des différences statistiquement significatives (Log2 FC > 1 et valeur p < 0,05). Comme la phospho-tyrosine TMT du cœur global entier normalisée sur les données complètes du protéome, les changements d'expression protéique statistiquement significatifs ont été soumis à MSigDB pour l'analyse des voies. Les résultats sont présentés dans les données supplémentaires 4.

Nous avons utilisé 146 phospho-sites correspondant à 50 protéines pour analyser la phosphorylation du protéome pTyr ou le protéome pTyr normalisé. Les souris TgErbB2 ont montré des changements significatifs dans 21 sites pTyr (Fig. 5g) correspondant à 15 protéines. Une augmentation substantielle de pTyr a été détectée sur MLC1-Y82, Y139, Myh6-Y1310, α-Tm-Y261, Actin-Y168, MyBP-C-Y544 et Actinin2-Y200, entre autres protéines. L'analyse de la voie MsigDB a donné des résultats similaires à l'approche globale de la phospho-tyrosine TMT sur des cœurs entiers (Fig. 3). Les données pTyr du sarcomère TgErbB2 montrent également que les voies les plus importantes sont le DCM et le HCM (Fig. 5g, h). Fait intéressant, lorsqu'ils sont normalisés à l'ErbB2 total, les niveaux de phosphorylation d'ErbB2-Y1006 diminuent. D'autre part, l'analyse des voies PTMsigDB ne correspondait à aucune voie car de nombreux sites sont nouveaux et ne sont pas signalés dans la base de données PTMsigDB.

Nos données montrent que l'enrichissement en protéines de sarcomère a détecté plus de peptides pTyr du myofilament qui ont été manqués dans l'approche globale des lysats de cœur entier. Cependant, le nombre total de peptides tyrosine-phosphorylés et de protéines correspondantes était inférieur.

KSEA a été utilisé pour caractériser les changements de signalisation induits par le génotype en estimant l'activité relative de la kinase chez les souris TgErbB2 et R403Q-αMyHC en utilisant les données protéomiques quantitatives pTyr TMT et TMT du sarcomère pTyrosine du cœur entier, en utilisant leurs groupes Ntg respectifs comme référence. KSEA29 est une méthode qui déduit l'activité différentielle des kinases en fonction de la phosphorylation différentielle de ses substrats et calcule des scores qui reflètent le changement directionnel de l'activité de chaque kinase. Cette méthode suppose que l'activité différentielle des kinases est corrélée avec les changements de phosphorylation dans ses substrats. Un score positif correspond à une kinase avec des substrats phosphorylés chez les souris Tg par rapport au contrôle Ntg. De même, un score négatif est une hypophosphorylation en Tg par rapport à leur contrôle Ntg. Les données d'interaction kinase-substrat ont été téléchargées à partir du site Web PhosphoSitePlus30. Ensuite, la méthode KSEA a été appliquée à tous les sites pTyr identifiés dans ces expériences. Nous avons identifié 34 phosphosites qui ont des kinases associées rapportées sur PhosphoSitePlus. Cependant, 49 kinases uniques ont été notées dans les ensembles de données combinés. Une carte thermique KSEA déduit des grappes de kinases régulées à la baisse (échelle de couleur bleue) ou régulées à la hausse (échelle de couleur rouge) est illustrée à la Fig. 6a. Les souris TgErbB2 ont affiché une régulation négative significative de MAP2K4, MAP3K6, MAP3K5, MAP2K3 et MAP2K6, et une régulation positive marquée de EPHA4. D'autre part, R403Q-αMyHC Tg a présenté une régulation à la baisse substantielle de GSK3B (voir le rectangle bleu en surbrillance sur la figure 6a). R403Q-αMyHC Tg présentait un plus grand groupe de kinases significativement régulées positivement (voir le rectangle rouge en surbrillance sur la figure 6a).

a KSEA sur l'enrichissement pTyr de cœurs entiers et les données d'enrichissement TMT pTyr Myofilament. Les cartes thermiques rapportent les résultats KSEA en fonction des scores normalisés (c'est-à-dire TgErbB2/Ntg, R403Q-αMyHC/Ntg, etc.). Seules les kinases partagées entre les jeux de données sont incluses, donc présentes dans Tg et Ntg. Les astérisques indiquent la signification statistique de p < 0,05. Le rouge représente un score positif et le bleu un score négatif. Le rectangle rouge met en évidence les groupes de kinases activées regroupées et prédominantes dans R403Q-αMyHC, tandis que le rectangle bleu met en évidence les kinases supprimées qui se sont regroupées et sont prédominantes sur les cœurs entiers TgErbB2. b MoBaS a identifié un sous-réseau étroitement interconnecté impliqué dans la signalisation des facteurs de croissance (ERBB, PDGFRA et EGFR1). Représenté par le sous-réseau PPI le mieux noté, appelé module 1, il a été identifié sur l'enrichissement pTyr du cœur entier en TgErbB2 et comparé à R403Q-αMyHC. c KSEA sur le groupe de substrats du module 1, MsigDB et PTMsigDB. d Le deuxième sous-réseau PPI le mieux noté appelé Module 2 a été identifié sur l'enrichissement pTyr du cœur entier R403Q-αMyHC et comparé à TgErbB2. e KSEA sur le groupe de substrats du module 2 montre des kinases activées dans R403Q-αMyHC. Les résultats des analyses PTMsigDB et MSigDB ont identifié l'EGFR1, le cytosquelette d'actine, l'ERBB et la signalisation Focal Adhesion. Chaque nœud est une phosphoprotéine représentée par son peptide le plus significatif sur les modules PPI. La couleur des nœuds est basée sur le changement de pli Log2 par rapport à NTG. L'échelle est notée FC et une barre colorée du bleu au rouge.

L'analyse conventionnelle des voies peut manquer des groupes de protéines car les algorithmes des voies sont prédéfinis et rigides. Une approche de réseau d'interaction protéine-protéine (PPI) pourrait mieux capturer les réponses de signalisation dans ces modèles qui ne sont généralement pas détectées par l'analyse des voies. Pour ce faire, MoBaS Analysis22,31 a été utilisé pour identifier les sous-réseaux densément connectés qui sont liés et pourraient présenter une phosphorylation différentielle dans les modèles Tg. Plusieurs modules ont été identifiés, et nous nous sommes concentrés sur les deux principaux modules PPI statistiquement significatifs du flux global de TMT du cœur entier à travers l'ensemble de données ; à des fins d'interprétation, ils ont été désignés comme module 1 et module 2. Les substrats des modules 1 et 2 sont illustrés sur les figures 6b, d, respectivement.

Fait intéressant, l'analyse de la signature moléculaire au niveau du site PTMsigDB a montré que le module 1 contenait des modifications significatives spécifiques au site pour la voie EGFR1. De plus, en utilisant l'analyse MSigDB Gene-Protein Level, plusieurs voies, telles que la signalisation ErbB, PDGFRA et les voies d'adhésion focale, ont montré une signification statistique. La KSEA du réseau protéine-protéine du module 1 met en évidence une activation significative d'AURKB (aurora kinase B) et de CSNK2A1 (Fig. 6c).

De même, l'analyse PTMSigDB pour le module 2 a confirmé l'implication de la voie EGFR1 tandis que MsigDB a détecté le cytosquelette d'actine, la signalisation ErbB et les voies d'adhésion focales. KSEA du réseau protéine-protéine du module 2 met en évidence une activation significative de SRC, MAP2K1, HCK, LCK, SYK, JAK3, JAK2, FYN, PTK6 et ABL1 chez les souris R403Q-αMyHC (Fig. 6e). Ces données confirment que MoBAS a identifié des modules fonctionnellement pertinents de PPI parmi les peptides pTyr identifiés, et PTMsigDB a indiqué la voie EFGR1 comme une voie commune pour HCM à partir de deux modèles de souris non apparentés.

Les cœurs de souris TgErbB2 développent un type concentrique de HCM. Cette altération évolue rapidement vers une HCM pathologique, montrant des caractéristiques telles que la fibrose, le désordre des cardiomyocytes, la manipulation perturbée du Ca2+, les arythmies et la mort subite16. Sur ces bases, nous avons émis l'hypothèse que la neutralisation pharmacologique de l'activité de la surexpression cardiaque d'ErbB2, un récepteur tyrosine kinase, utilisant AG-825 (un inhibiteur d'ErbB2), stopperait la progression du phénotype histopathologique. À cette fin, des souris TgErbB2 (âgées de 6 à 9 mois) avec des témoins HCM et Ntg établis ont été traitées avec un véhicule AG-825 ou DMSO pendant deux semaines, par voie sous-cutanée deux fois par jour à une dose de 1 mg/Kg16. Ensuite, la fibrose myocardique a été évaluée par la coloration au trichrome de Masson. Les souris TgErbB2 non traitées ont développé des quantités variables de fibrose du ventricule gauche (Fig. 7a, b); cependant, les souris traitées avec TgErbB2 présentaient moins de fibrose (Fig. 7b). En revanche, l'histologie cardiaque n'a pas été affectée par le traitement AG-825 chez les souris Ntg. Nous avons utilisé CytoSpectre32, une interface utilisateur graphique Web, pour caractériser les effets de l'AG-825 sur le désordre des cardiomyocytes ; cette interphase détermine l'orientation locale des structures, dont les myocytes cardiaques, à travers les coupes histologiques, similaire à l'analyse décrite précédemment par le laboratoire de Seidman33. Des régions d'intérêt choisies au hasard sont représentées sur la figure 7a et augmentent le grossissement des microphotographies de 5X à 40X (figure 7b). La variance de l'angle d'orientation des myocytes a été évaluée, appelée variance circulaire et signifie la variance des angles d'orientation. Ntg traité avec le véhicule (Fig. 7c) par rapport à Ntg AG-825 traité (Fig. 7c) n'était pas significativement différent (Fig. 7d), comme déjà décrit33. En revanche, les cardiomyocytes de souris TgErbB2 traités avec le véhicule présentaient une variance d'angle d'orientation sensiblement différente du contrôle Ntg-Véhicule ; voir la forme hétérogène et plus large du tracé d'orientation sur la Fig. 7c. Étonnamment, les cardiomyocytes des souris TgErbB2 traitées par AG-825 ont affiché beaucoup moins de désordre, comme en témoigne le retour significatif de la variance circulaire et de la forme du tracé aux témoins traités par Ntg-Véhicule ou AG-825 (Fig. 7e, p = 0,0014 par One- façon ANOVA). Cette analyse suggère que les cardiomyocytes des souris TgErbB2 traitées par AG-825 affichent significativement moins de désordre myocytaire, comme l'indique la variance circulaire réduite.

a Coupes colorées au trichrome de Masson (5X) de souris Ntg traitées au véhicule et Ntg traitées à l'AG-825 et TgErbB2 traitées au véhicule et TgErbB2 traitées à l'AG-825, les pointes de flèches jaunes pointent vers les zones fibrotiques. Barre d'échelle 1 mm. b Les coupes colorées au trichrome de Masson (40X) provenant de régions représentatives d'intérêt montrent une fibrose accrue dans le myocarde des souris TgErbB2, cette fibrose s'améliorant après 2 semaines de traitement AG-825. Les mêmes zones ont été utilisées pour déterminer le niveau de désarroi des myocytes cardiaques, qui a été obtenu en analysant l'orientation des cellules à l'aide du logiciel CytoSpectre de Vehicle et des sections cardiaques de souris Ntg et TgErbB2 traitées à l'AG-825 (barre d'échelle 50 μm). c Tracés de la distribution des angles d'orientation des cellules cardiaques. Notez comment les angles Ntg sont homogènes et n'ont pas changé dans le groupe traité avec AG-825. En revanche, la Tg traitée avec le véhicule a montré des angles d'orientation moins homogènes et différents, confirmant le désarroi des cardiomyocytes. Le traitement AG-825 réduit le désordre des cardiomyocytes et le tracé d'orientation est similaire à celui du groupe NTG traité par AG-825. d Angle d'orientation moyen des myocytes cardiaques, et e Variance circulaire, une autre mesure de l'isotropie, chez les souris Ntg et TgErbB2 avec et sans traitement AG-825 (n = 5 animaux par condition). Les barres du graphique sont exprimées en moyenne ± sem ; un test ANOVA à une voie a été effectué pour des comparaisons statistiques montrant une amélioration significative chez les souris TgErbB2 traitées avec AG-825 (valeur de p <0,0014). f L'échocardiographie cardiaque des quatre groupes montre que le traitement AG-825 pendant 14 jours n'a pas modifié la fonction contractile, estimée en % de fraction de raccourcissement.

Ensuite, nous avons évalué l'impact direct in vivo de l'inhibition d'ErbB2 par AG-825 sur la contractilité, les échocardiogrammes et l'imagerie tissulaire-doppler pour évaluer la fonction diastolique. Ces études ont été réalisées sur des souris conscientes (non anesthésiées), au départ et après deux semaines de traitement. Nous avons utilisé un système d'imagerie haute résolution Vevo 2100 avec un transducteur de 40 MHz (VisualSonics®, Toronto). Les données ont ensuite été analysées avec un logiciel Advanced Cardiovascular Package. Les paramètres étudiés étaient les dimensions de la chambre, le raccourcissement fractionnaire, la fraction d'éjection et la dynamique de la vitesse Doppler tissulaire. Les données fonctionnelles du ventricule gauche obtenues par imagerie échocardiographique parasternale à petit axe n'ont déterminé aucun changement significatif dans le raccourcissement fractionnel moyen au fil du temps chez les souris TgErbB2 traitées avec la solution de véhicule par rapport au Ntg (Fig. 7f). De même, les souris TgErbB2 traitées avec AG-825 n'ont pas présenté de changements significatifs de la fonction contractile au fil du temps par rapport aux souris Ntg AG-825 traitées (Fig. 7f). L'imagerie Doppler tissulaire n'a détecté aucune différence significative dans la fonction diastolique ; voir les données complètes d'échocardiographie dans les données supplémentaires 6. Ces données suggèrent que l'inhibition pharmacologique d'ErbB2 a arrêté ou inversé le remodelage pathologique en réduisant la réponse fibrotique et en restaurant l'alignement des cardiomyocytes. Pourtant, cette réponse n'a pas été mise en parallèle par la préservation in vivo de la fonction contractile du VG chez les souris TgErbB2.

Nous avons revisité la phosphoprotéomique de TgErbB2 et NTg pour valider les découvertes bioinformatiques de KSEA et pour étudier l'impact de l'inhibiteur de tyrosine kinase AG-825 sur le protéome. Nous avons utilisé une approche de marquage TMT 13-plex pour comparer le profil de phosphorylation du cœur entier des souris Ntg et TgErbB2 traitées avec le véhicule ou AG-825 (inhibiteur ErbB2). En bref, un TMT 13-plex a été réalisé comme suit ; Ntg-Vehicle (n = 3), traitement Ntg-AG-825 (n = 3), TgErbB2-Vehicle (n = 3) et traitement TgErbB2-AG-825 (n = 4). Des lysats de protéines cardiaques entières ont été isolés à partir de cœurs thermiquement stabilisés et traités comme décrit à la Fig. 2 et "Matériel et méthodes". La majeure partie du matériel a été utilisée pour enrichir les peptides pS/pT/pY, et une petite partie est marquée pour quantifier le protéome complet avec TMT. Comme décrit dans l'expérience précédente de la figure 2, l'intensité des peptides pS/pT/pY est normalisée à l'intensité des signaux TMT du protéome complet. Un total de 6614 protéines, 4732 peptides sérine et thréonine phosphorylés et 346 peptides pTyr ont été quantifiés par les ions rapporteurs TMT. L'ensemble de données complet est disponible dans les données supplémentaires 7.

Les cartes thermiques de l'intensité des peptides sérine / thréonine phosphorylés ou tyrosine phosphorylés normalisés, régulés à la hausse ou à la baisse, confirment l'influence du génotype sur tout le remodelage du phosphoprotéome, la phosphorylation de la sérine et de la thréonine (Fig. 8a) et pTyr (Fig. 8b). Nous avons directement interrogé les données avec MSigDB et PTMSigDB pour comparer Ntg avec des souris TgErbB2. Comme prévu, nous avons confirmé l'implication de la voie EGFR1 par PTMSigDB dans l'hypertrophie cardiaque des souris TgErbB2 traitées avec le véhicule (Fig. 8c, d) ou AG-825 (Fig. 8e, f). En outre, nous avons confirmé l'implication de l'adhésion focale et des voies de la matrice extracellulaire par MSigDB chez les souris traitées avec le véhicule et la cardiomyopathie dilatée, la HCM et la cardiomyopathie arythmogène du ventricule droit (ARCV) chez les souris traitées à l'AG-825. Cependant, le traitement AG-825 pendant 14 jours a eu un effet subtil chez les souris TgErbB2 qui n'était pas évident par MsigDB ou PTMsigDB. Puisque nous avons inclus tous les phosphoprotéomes, nous avons estimé l'activité kinase dans le peptide de phosphorylation de la sérine et de la thréonine. Les kinases régulées à la hausse et à la baisse ont été identifiées à l'aide de KSEA, et le résultat est présenté à la figure 8g. L'analyse complète de la KSEA et des voies est disponible dans les données supplémentaires 5 et les données supplémentaires 7. Nous avons comparé l'activité des kinases chez les animaux traités à l'AG-825 par rapport à leur témoin (traitement par véhicule). Nous avons identifié un petit groupe de kinases significativement inhibées ou régulées à la baisse par le traitement AG-825 et non par le traitement par véhicule (voir le rectangle rouge en surbrillance sur la figure 8g). Pour mieux comprendre l'impact fonctionnel du point de vue de la biologie du système, nous avons exploré la relation entre ces kinases à l'aide du logiciel de visualisation The Signaling Network Open Resource (Signor 2.0)34. La figure 8h montre que la plupart de ces kinases sont en aval de l'EGFR, mises en évidence dans des cercles en pointillés bleus. Dans l'ensemble, nos données indiquent que l'EGFR1 est au cœur de l'hypertrophie de la TgErbB2 et que le traitement AG-825 inhibe l'ErbB2 et l'EGFR ; par conséquent, un sous-ensemble important de cibles en aval de la cascade de signalisation EGFR est affecté.

a Une carte thermique a été utilisée pour visualiser le regroupement hiérarchique non supervisé des peptides Ser/Thr, et b Les peptides pTyrosine ont été normalisés à l'expression complète du protéome avec une valeur p <0,05 par ANOVA. Surreprésenté (jaune) et sous-représenté (bleu). c Parcelles volcaniques montrant le changement de pli Log2 et la valeur p -Log10 de chaque peptide pSer/pThr et d pTyr dans la comparaison par paires de Ntg et TgErbB2 après deux semaines de traitement par véhicule. e Parcelles volcaniques montrant le changement de pli Log2 et la valeur p -Log10 de chaque peptide pSer/pThr et f peptides pTyr dans la comparaison par paires de Ntg et TgErbB2 après deux semaines de traitement AG-825, (g) KSEA apparaît en rouge rectangle les kinases significativement inhibées par AG-825. KSEA et l'analyse d'enrichissement de la voie de l'analyse des données de phosphorylation combinée Ser/Thr/Tyr à l'aide de PTMSigDB confirment que la voie EGFR1 est significativement impliquée. h L'analyse Signaling Network Open Resource (Signor 2.0) montre que neuf kinases sont impliquées dans la voie EGFR. Les kinases trouvées dans le réseau et également dans KSEA sont entourées de cercles bleus en pointillés. Le code symbole du réseau est affiché à côté du chemin.

La présente étude démontre que le protéome pTyr du cœur est altéré dans les protéines liées aux cardiomyopathies, sérine/thréonine et tyrosine kinases dans deux modèles pathogéniquement non liés de cardiomyopathie hypertrophique (HCM), à savoir la surexpression cardiaque spécifique de ErbB2 et l'expression allélique de R403Q-αMyHC. De plus, le phosphoprotéome sérine/thréonine du cœur est également altéré dans l'hypertrophie cardiaque du modèle murin TgErbB2. Au total, nos données indiquent que l'activation de la voie EGFR est impliquée de manière centrale dans l'hypertrophie cardiaque qui provient de deux modèles de souris très différents.

La dysfonction contractile de l'insuffisance cardiaque est, en partie, due à la désensibilisation du myofilament au Ca2+. La phosphorylation sérine/thréonine altérée du sarcomère cardiaque et la sensibilité réduite du myofilament au Ca2+ sont des caractéristiques des modèles humains et expérimentaux d'insuffisance cardiaque et jouent un rôle dans la physiopathologie de la HCM et de la DCM7,35,36. Nous avons précédemment identifié pTyr dans la troponine I Y26 cardiaque humaine qui était régulée négativement dans l'insuffisance cardiaque humaine et le DCM14. Cependant, aucune étude n'a encore abordé l'impact du pTyr cardiaque dérégulé global dans la pathogenèse des maladies cardiaques.

Ici, nous montrons des preuves que dans le cœur des souris TgErbB2, le phosphoprotéome de la tyrosine est altéré de manière différentielle, la régulation à la hausse et la régulation à la baisse des phosphopeptides de la tyrosine. L'analyse de la voie MsigDB a démontré l'implication de la signalisation ARVC, HCM, DCM et intégrine alphaIIB beta3 dans les cœurs de souris TgErbB2. La plupart des protéines de sarcomère présentaient une régulation négative significative de pTyr, telles que Myh7-Y386, Y410, Y1375, Myh6-Y1349 et Ttn-Y2118, Y21190, à l'exception de Ttn-Y31324 qui était régulée positivement. Le changement directionnel de pTyr dans ces protéines de sarcomère est une régulation négative, tout comme il a été rapporté pour la cTnI Y26 humaine dans l'insuffisance cardiaque et le DCM. On sait très peu de choses sur le rôle de pTyr des protéines sarcomères. En fait, un seul groupe37 a examiné les tyrosine kinases potentielles qui phosphorylent la cTnI. Ils ont démontré in vitro que c-Src et un autre membre de la famille des kinases Src, Lyn, phosphoryle le cTnIY26, signalant que la phosphorylation et la pseudo-phosphorylation imitant ce site réduisaient la sensibilité du myofilament au Ca2+, comme en témoigne la réponse force-calcium altérée des myofilaments. Il convient de noter que la phosphorylation de cTnI Y113, un nouveau site découvert, a été régulée négativement chez les souris R403Q-αMyHC. Nous avons également démontré une régulation négative significative de pTyr dans Ttn-Y1881, Y1902 et Y33864. Contrairement aux souris TgErbB2, Myh7-Y410 était régulé positivement chez les souris R403Q-αMyHC. pTyr à Myh7-410 est proche de R403Q αMyHC et pourrait avoir un impact fonctionnel puisqu'il se trouve dans la tête du domaine moteur de αMyHC. Les implications spécifiques au site de ces changements méritent une étude plus approfondie ; cependant, cela dépasse le cadre du présent travail. Fait intéressant, dans les cœurs R403Q-αMyHC, le protéome pTyr est également modifié différemment. Cependant, chez les souris R403Q-αMyHC, davantage de peptides phosphotyrosine ont atteint une signification statistique. Contrairement à TgErbB2, l'analyse de la voie MsigDB a démontré que les souris R403Q-αMyHC présentaient des altérations dans les voies du récepteur de la tyrosine kinase, le récepteur de l'angiopoïétine, ErbB et la signalisation du récepteur de l'hormone de croissance. Alors que PTMsigDB a révélé l'altération de la voie EGFR1 et du carcinome épidermoïde. Nous avons estimé que la surexpression d'un récepteur tyrosine kinase dans le cœur des souris TgErbB2 entraînerait une altération plus significative du protéome pTyr. Cependant, les données suggèrent qu'une seule mutation ponctuelle du sarcomère, comme dans le cas des souris R403Q-αMyHC, est suffisamment incisive pour altérer de manière significative le protéome pTyr cardiaque. La protéomique descendante38 a démontré que des altérations cohérentes de la phosphorylation de cTnI, ENH2 et d'autres protéines du disque Z dans le myocarde HCM étaient mieux corrélées avec le phénotype, quelle que soit la mutation causant la maladie à un seul point du sarcomère. Les mécanismes par lesquels une mutation pathogène dans la chaîne lourde de la myosine (R403Q-αMyHC) peut affecter la régulation de pTyr sont inconnus et justifient une enquête plus approfondie.

La dérégulation globale de pTyr dans le modèle de souris TgErbB2 est essentielle car elle relie une hypertrophie cardiaque prononcée, un dysfonctionnement du sarcomère et une manipulation anormale du calcium16 avec des altérations des voies de la tyrosine kinase. D'autre part, l'inhibition pharmacologique d'ErbB2 (HER2/neu) avec l'inhibiteur lapatinib chez les patientes atteintes d'un cancer du sein traitées par la doxorubicine augmente le risque de développer une insuffisance cardiaque par rapport aux patientes traitées par la doxorubicine seule39. Cela suggère que le maintien de l'homéostasie pTyr peut être nécessaire pour réguler la fonction et l'homéostasie des cardiomyocytes.

Une grande variété d'autres cibles fonctionnellement pertinentes ont été identifiées dans cette étude avec pTyr, des protéines de sarcomère au disque z, des filaments intermédiaires (tels que la desmine), des composants desmosomes, des protéines d'adhérence focale et de jonction d'adhérence, des récepteurs membranaires, des kinases et des phosphatases. . Par exemple, pTyr dans plusieurs protéines associées au disque z a été noté (pour une liste complète, voir les données supplémentaires 2, 3 et 6). Les protéines du disque Z sont cruciales pour la contraction musculaire et le stress mécanique, la croissance et la signalisation métabolique40. En outre, l'altération des niveaux de phosphorylation du composant clé desmosomes, le peptide Pkp2-Y119 de la protéine Plakophilin-2 (Pkp2), a été notée dans les deux modèles de souris, une régulation à la hausse dans R403Q-αMyHC Tg et une régulation à la baisse dans TgErbB2. L'effet fonctionnel de la régulation à la hausse ou à la baisse de la phosphorylation de Pkp2-Y119 n'est pas connu. Cependant, la délétion homozygote de Pkp2 perturbe l'architecture du cœur et est létale dans l'embryon41. Dans le cœur, Pkp2 est nécessaire pour assembler le desmosome et l'activité PKC42. Les mutations autosomiques dominantes de ce gène sont responsables de 25 à 50 % des CVDA. Fait intéressant, les souris TgErbB2 ont une sensibilité accrue aux arythmies et au désordre myofibrillaire16, similaire aux patients présentant des mutations de la myosine et HCM. Les changements de phosphorylation de Pkp-Y119 pourraient avoir un impact sur le phénotype.

La voie EGFR1 (ErbB1) joue un rôle central dans l'hypertrophie cardiaque dans les deux modèles Tg. L'inhibition pharmacologique de l'EGFR, à l'aide de l'AG-1478, protège contre l'hypertrophie cardiaque induite par l'angiotensine II in vitro et in vivo43. L'hypertrophie concentrique associée à la surexpression spécifique cardiaque d'ErbB2 peut être inversée par l'administration précoce de lapatinib, qui inhibe le récepteur tyrosine kinase12 de l'EGFR en plus d'ErbB2. Dans cette étude, le blocage pharmacologique du récepteur ErbB2 par AG-825 chez des souris adultes TgErbB2 a réduit le désordre des myocytes mais n'a pas préservé la fonction cardiaque ni modifié l'hypertrophie cardiaque. Nous pensons que l'absence de réponse est liée à l'âge des souris au moment de l'administration : dans la présente étude, nous avons utilisé des souris adultes, alors que des ratons ont été utilisés dans des études précédentes15. Nous avons également évalué la sérine/thréonine cardiaque et le protéome pTyr dans TgErbB2 après un traitement par véhicule ou AG-825. Nous avons trouvé des altérations globales dans le phosphoprotéome (Fig. 8) qui ont confirmé l'implication de la voie EGFR. De plus, nous avons confirmé les altérations des voies d'adhérence focale, de la matrice extracellulaire, du DCM, du HCM et de l'ARCV. Nous avons utilisé KSEA pour associer les résultats à un sous-ensemble de kinases activées et le réduire aux 40 sérine/thréonine et tyrosine kinases les plus représentatives détectées dans le protéome cardiaque des souris Ntg et TgErbB2. Le traitement AG-825 pourrait inhiber ou réduire de manière significative l'activation de 14 kinases correspondant à la voie EGFR (Fig. 8g, h), ce qui suggère que le traitement AG-825 était efficace et spécifique. Dans l'ensemble, ces découvertes indiquent que les altérations du protéome cardiaque s'étendent à la sérine/thréonine et pTyr, confirmant l'implication des voies décrites ci-dessus. De plus, ces données suggèrent que les modifications induites par le traitement à l'AG-825 dans le phosphoprotéome étaient corrélées à une amélioration du désordre des myocytes cardiaques.

Le KSEA impliquait une régulation négative marquée des membres de la voie canonique MAPK en aval de k-Ras chez les souris TgErbB2. À l'inverse, chez les souris R403Q-αMyHC, nous avons observé une régulation à la hausse de l'adhérence focale et des voies de signalisation PDGFR-bêta (SRC, LYN, LCK, JAK2, INSR, MAPK1 et HCK). Plus important encore, l'analyse de notation basée sur la modularité (MoBas) a identifié des sous-réseaux d'interaction protéine-protéine enrichis en ErbB, PDGFRA et voies d'adhésion focale et activation de l'aurora kinase B et CSNKA1. Ces données indiquent que de nombreuses cibles se chevauchent dans les deux modèles transgéniques d'hypertrophie cardiaque. Bien qu'il existe des différences marquées dans les régulateurs en amont d'ErbB2 et de la chaîne lourde de la myosine, de nombreuses molécules effectrices en aval sont communes et peuvent être ciblées par des inhibiteurs à petites molécules (conçus initialement pour traiter plusieurs types de cancer) pour bloquer l'hypertrophie cardiaque.

La voie MAPK est impliquée dans la réponse adaptative et inadaptée qui pourrait conduire à une hypertrophie cardiaque (pour revue44). La voie de signalisation RAS-RAF-MEK-ERK est une cible intéressante pour l'intervention thérapeutique en oncologie. Plusieurs inhibiteurs sélectifs de petites molécules de la RAF et de la MEK ont été testés dans des essais cliniques45. La présente étude a révélé une augmentation de la phosphorylation au niveau de MAPK1-Y185, qui active la kinase dans R403Q-αMyHC, et l'activité de MAPK1 est directement liée à l'hypertrophie cardiaque46. La c-Src, la kinase centrale de sa famille, pourrait être l'un des régulateurs potentiels des modifications du protéome pTyr observées dans R403Q-αMyHC car elle phosphoryle le récepteur EGFR en amont et phosphoryle Stat, entre autres cibles, en aval. c-Src affecte la réponse à l'étirement mécanique des cardiomyocytes en déclenchant une cascade de signalisation intracellulaire dans les cardiomyocytes vers une réponse hypertrophique47,48. En outre, c-Src phosphoryle PXN-Y11849, et ce site avait une augmentation de 25 fois de la phosphorylation chez les souris R403Q-αMyHC. Fait intéressant, c-Src intervient dans l'activation de MAPK1 et MAPK3 en réponse à une surcharge de pression47. Notamment, une étude antérieure a montré que l'hypertrophie cardiaque induite par la surcharge de pression est exacerbée chez les souris R403-αMyHC Tg50, ce qui suggère que le mécanisme par lequel la mutation R403-αMyHC produit une hypertrophie cardiaque consiste à sensibiliser les cellules à la signalisation induite par la surcharge de pression via c -Src.

Les souris R403Q-αMyHC ont présenté une phosphorylation améliorée de JAK2, STAT5A et STAT5B dans les sites d'activation (Y570, Y694 et Y699, respectivement), ce qui indique non seulement l'activation de la signalisation MAPK, mais également l'activation de la signalisation JAK-STAT. Signalisation Jak-Stat : la voie IL-6 est activée en réponse à la famille de cytokines IL-6 (IL-6, cardiotrophine 1 et facteur inhibiteur de la leucémie), interagit avec la voie EGFR et est impliquée dans l'hypertrophie cardiaque. Cette voie a des effets cardioprotecteurs, mais l'activation chronique peut entraîner une hypertrophie cardiaque (examinée dans la réf. 44). Vakrou et ses collègues ont effectué une analyse des voies sur les profils de miARN de R403Q-αMyHC. Ces auteurs ont trouvé des similitudes avec les découvertes décrites dans ce travail, telles que la suractivation de la signalisation des chimiokines (CXCR4), le cytosquelette d'actine et les voies de signalisation de l'hypertrophie cardiaque51. Ces résultats suggèrent une implication essentielle de la régulation de pTyr dans les myofilaments et d'autres protéines cardiaques. Les connaissances acquises grâce à ces études pourraient éclairer de nouvelles approches thérapeutiques dans la HCM liée à la mutation du sarcomère et potentiellement d'autres conditions associées à la HCM. Les études se sont limitées à deux modèles de souris transgéniques qui développent une hypertrophie cardiaque ; d'autres modèles de mutations du sarcomère ou de surcharge de pression tels que les bandes aortiques pourraient être explorés et comparés. Certains sites tyrosine-phosphorylés pertinents pourraient être manqués en raison de leur faible stoechiométrie et des défis techniques. Ce problème est particulièrement vrai pour les protéines liées à la membrane, qui sont difficiles à évaluer dans les études phosphoprotéomiques.

Cette étude révèle que les modèles pTyr modifiés sont frappants dans deux modèles distincts de HCM. De plus, malgré certains sites partagés, des formes étiologiquement différentes de HCM peuvent héberger des signatures pTyr spécifiques qui indiquent que la voie EGFR est centrale dans les deux modèles transgéniques. Cette preuve, combinée à l'inhibition d'un récepteur tyrosine kinase spécifique à l'aide de la tyrphostine AG-825, peut inverser le désarroi des cardiomyocytes et rationaliser les approches pour manipuler le protéome pTyr en tant qu'approche thérapeutique pour la HCM. De plus, ces études indiquent que les inhibiteurs de la tyrosine kinase, désormais largement utilisés dans les thérapies anticancéreuses, peuvent modifier la fonction cardiaque en modifiant directement les profils de la tyrosine kinase et de la sérine/thréonine kinase du cœur.

Les lysats cardiaques entiers du tissu stabilisé à la chaleur ont été remis en suspension dans un tampon SDS à 1%, 10 à 15 μg ont été séparés par SDS-PAGE et transférés sur des membranes de nitrocellulose. Les membranes ont été bloquées avec 5 % de BSA dans du tampon TBS-T (20 mmol/L Tris pH 7,4, 150 mmol/L NaCl et 0,1 % Tween 20) pendant 1 h à température ambiante, puis ont été incubées avec une dilution d'anticorps primaire 1:1000 dans 1 % BSA-TBS-T ; AcM de souris phospho-Tyrosine (pTyr-100, n° de catalogue 9411SCST), Ac de lapin TnI (n° de catalogue 4002SCTS), Ac de lapin Src (n° de catalogue 2108SCST), Famille Phopsho-Src (Tyr416) ​​AcM de lapin (D49G4) , cat. No.6943T CST), GAPDH Rabbit Ab (14C10, cat. No. 2118S CST) à 4 °C pendant une nuit. Après les avoir lavés cinq fois, les anticorps secondaires ont été dilués au 1/10 000 dans du BSA-TBS-T à 1 % (anti-Rabbit IgG-HRP linked (cat. No. 7074S CTS), Anti-Mouse m-IgGk BP-HRP (cat. . No. sc-516102, Santa Cruz) et incubées pendant 1 h à température ambiante. Ensuite, les membranes ont été développées avec le super signal West Pico Chemiluminescent Substrate (Thermo), et les bandes immunoréactives ont été détectées par chimiluminescence avec un iBright 1500 (Invitrogen Les images ont été obtenues et analysées avec le logiciel Image J. Une ANOVA à une voie a été utilisée pour comparer les groupes et déterminer la signification statistique.

Tous les protocoles ont été exécutés en suivant le "Guide pour l'utilisation et le soin des animaux de laboratoire" publié par les National Institutes of Health et l'approbation du Comité institutionnel de protection et d'utilisation des animaux. Les souris TgErbB2 (coloration B6SJLF1/J) et R403Q-αMyHC (C57/Bl6) ont été obtenues auprès du Dr K. Gabrielson et du Dr LA Leinwand, respectivement16,17, pour établir des colonies de reproduction. Des souris mâles ou femelles (6-9 mois) ont été anesthésiées avec une surdose de pentobarbital sodique IP (75 mg/kg) ou d'isoflurane (5 %) ; les cœurs ont été rapidement disséqués, suivis d'une stabilisation thermique (Denator T1 Heat Stabilizor, Suède) et stockés à -80 ° C jusqu'à analyse. Des cœurs de souris TgErbB2 et R403Q-αMyHC (n = 5 par groupe) ont été traités en parallèle. Pour obtenir des lysats cardiaques entiers, les ventricules cardiaques (~ 200 mg) ont été homogénéisés sur un tampon glacé : HEPES 20 mM, pH 7,6, 1 mM, pyrophosphate de sodium 1,5 mM, PhosStop et urée 9 M à 10 μl/mg (poids humide de tissu). L'homogénat a été refroidi sur de la glace, suivi d'une brève sonication à micro-pointe sur de la glace, centrifugation à 10 000 × g pendant 15 min à 4 ° C. Le surnageant a été récupéré et la concentration en protéines a été déterminée par la méthode de Lowry (Bio-Rad).

Les protéines des lysats cardiaques ont été réduites dans 5 mM de dithiothréitol (DTT) à 60 ° C pendant 20 min et alkylées dans 10 mM d'iodoacétamide (IDA) à température ambiante pendant 15 min dans l'obscurité. Chaque échantillon (30 mg par souris, n = 5 souris par génotype) a été digéré avec de la trypsine de qualité protéomique (Promega) dans un rapport de 1:200 dans de l'urée 2 M, un tampon HEPES 20 mM, pH 8,0 à température ambiante pendant la nuit. La digestion a été terminée avec de l'acide trifluoroacétique (1% TFA). Les échantillons ont été centrifugés (5 min à 1800g) et les surnageants ont été dessalés par extraction en phase solide (cartouche SepPak C18 10cc, Waters). Les élues ont été lyophilisées pendant trois jours à -20 °C.

Un total de 150 mg de peptides trypsinisés par génotype ont été regroupés et enrichis en pTyrosine, comme décrit précédemment52. Les peptides lyophilisés ont été mélangés dans 1,4 ml de tampon d'immunoprécipitation (tampon IAP 50 mM MOPS, pH 7,2, phosphate de sodium 10 mM, NaCl 50 mM, pH 7,0). Une solution stock de billes de protéine agarose G (Santa Cruz Biotechnology) 80 μL de slurry ont été conjugués avec 300 μg d'anticorps monoclonal Phospho-Tyrosine Mouse (p-Tyr-100, Cell Signaling Technology). Le conjugué billes-anticorps anti-p-Tyr a été transféré dans le tube du peptide et incubé avec une rotation douce pendant 2 h à 4 ° C. Les billes ont été lavées et éluées avec 55 μl et 45 μl d'acide trifluoroacétique (TFA) à 0,15 %, respectivement. Les deux rendements d'élution ont été mis en commun. Les mélanges de peptides résultants ont été purifiés par extraction en phase solide (étape conseils C18, Thermo Scientific). Les échantillons ont été séchés par centrifugation sous vide. Cette approche a été répétée trois fois avec des échantillons des trois groupes exécutés en parallèle, 15 cœurs par génotype en trois répétitions techniques. Le flux de tampon d'immunoprécipitation a été stocké à -80 ° C pour le 9-plex TMT ultérieur. Selon les instructions du fabricant, les peptides tryptiques ont été dessalés et marqués avec du TMT isobarique 9-plex (Thermo Scientific). La réaction de marquage a été effectuée pendant 1 h à température ambiante, suivie d'une trempe avec du Tris.HCl 100 mM (pH 8,0).

Les phosphopeptides ont été dissous dans 10 ul de TFA à 0, 1%, ACN à 2% (v / v) suivi d'une analyse RF-HPLC-ESI-MS / MS. Les phosphopeptides ont été séparés sur une colonne en phase inverse C18 avec un gradient linéaire d'acétonitrile (4 à 40 %) pendant 120 min, puis analysés sur un LTQ-Orbitrap Elite MS (ThermoFisher Scientific) avec HCD déclenché par la perte de neutro.

Les données MS brutes ont été recherchées avec Mascot 2.3 et une quantification sans étiquette avec des chromatogrammes d'ions extraits MS1 a été effectuée à l'aide du logiciel MaxQuant.

Les peptides ont été analysés sur Orbitrap Fusion Lumos Tribrid (Thermo Scientific) couplé au système de chromatographie liquide Easy-nanoLC 1200 nanoflow (Thermo Scientific). Les peptides de chaque fraction ont été reconstitués dans de l'acide formique à 10 % et chargés sur une colonne Acclaim PepMap100 Nano Trap (100 μm × 2 cm) (Thermo Scientific) garnie de particules C18 de 5 μm à un débit de 5 μl par minute. Les peptides ont été résolus à un débit de 250 nl/min en utilisant un gradient linéaire de 10 à 35 % de solvant B (0,1 % d'acide formique dans 95 % d'acétonitrile) pendant 120 min sur la colonne EASY-Spray (50 cm × 75 µm ID, PepMap RSLC C18 et particules C18 de 2 µm) (Thermo Scientific). Il a été monté sur une source d'ions EASY-Spray fonctionnant à une tension de 2,0 kV. L'analyse par spectrométrie de masse a été effectuée de manière dépendante des données avec des balayages complets de m/z 350 à 1500. La MS et la MS/MS ont été acquises et mesurées à l'aide de l'analyseur de masse Orbitrap. Les scans MS complets ont été mesurés à une résolution de 120 000 à m/z 200. Les ions précurseurs ont été fragmentés à l'aide d'une méthode de dissociation collisionnelle à plus haute énergie (35) et détectés à une résolution de masse de 30 000 à m/z 200. Proteome Discoverer 2.4 a été utilisé pour identification et quantification contre uniport_mouse_120119_UP000000589. Les paramètres de recherche utilisés sont les suivants : (a) trypsine (jusqu'à deux clivages manqués), (b) longueur minimale d'acides aminés : 6, (c) peptides minimum pour la protéine : 1, (d) modifications fixes TMT6plex sur n'importe quel N- extrémité et résidu de lyse, carbamidométhylation de la cystéine, (e) modifications dynamiques : oxydation sur la méthionine, acétyle sur l'extrémité N-terminale, perte de Met sur M et perte de Met + acétyle sur M et (f) taux de fausse découverte de 1 % pour le peptide et la protéine les niveaux.

Des préparations enrichies en myofilaments ont été obtenues en rinçant des cœurs fraîchement isolés dans du PBS glacé (inhibiteurs de protéinase Roche 1X et PhosStop 1X, Roche), du tissu auriculaire retiré et du tissu ventriculaire haché dans un tampon standard glacé (60 mM KCl, 30 mM Imidazole pH 7,0 , 2 mM MgCl2, inhibiteurs de protéinase Roche 1X et PhosStop 1X de Roche). Les tissus ventriculaires ont été homogénéisés avec un homogénéisateur (Omni tissue homogenizer TH) à vitesse maximale pendant 2 à 3 impulsions de 10 secondes avec la solution sur glace, centrifugée à 12 000 g pendant 15 min. Les pastilles de myofilaments ont été remises en suspension dans une solution de skinning (10 mK EGTA 8,2 mM MgCl2, 14,4 mM KCl, 60 mM imidazole pH 7,0, 5,5 mM ATP, 12 mM créatine phosphate, 10 U/mL créatine phosphokinase, 1 % Triton 100X, inhibiteurs de protéinase Roche 1X et PhosStop 1X de Roche) et incubés sur glace pendant 30 min28. Les culots de myofilaments ont été centrifugés à 1100 g pendant 15 min et lavés dans le tampon standard. Des pastilles de myofilaments fraîchement isolées ont été diluées dans un tampon standard et quantifiées avec le test de Lowery. Les protéines de myofilament (~ 7 mg) de chaque cœur de souris ont été remises en suspension dans de l'urée 8 M et du bicarbonate de triéthylammonium 50 mM (TEAB) (Sigma), suivies d'une réduction avec du dithiothréitol 10 mM (Sigma) à température ambiante pendant 1 h et alkylation avec iodoacétamide 30 mM (Sigma) pendant 20 min dans l'obscurité, voir Fig. 4a–d. Les échantillons de protéines ont ensuite été digérés pendant une nuit à 37 ° C en utilisant de la trypsine de qualité séquençage (1:50) (Promega). Les peptides tryptiques ont été dessalés et marqués avec des étiquettes de masse en tandem isobariques 6-plex (TMT) (Thermo Scientific) conformément aux instructions du fabricant. La réaction de marquage a été effectuée pendant 1 h à température ambiante, suivie d'une trempe avec du Tris.HCl 100 mM (pH 8,0). Les peptides digérés et marqués ont été regroupés et dessalés avec C18 SEP-PAK (Waters), suivis d'un enrichissement en pTyrsoine à l'aide du kit PTMScan® Phospho-Tyrosine Rabbit mAb (P-Tyr-1000) (Cell Signaling Technology), voir Fig. 4c. En bref, les peptides dessalés ont été reconstitués dans 1,4 ml de tampon de purification par immunoaffinité (IP) contenant 50 mM de MOPS pH 7,2, 10 mM de phosphate de sodium, 50 mM de NaCl. L'anticorps anti-phosphotyrosine (p-Tyr-1000, Cell Signaling Technology) a été mélangé avec une solution de peptide et incubé sur un rotateur à 4 ° C pendant 2 h. Après incubation, les billes ont été lavées avec du tampon IP et de l'eau deux et trois fois, respectivement. Les peptides de phosphotyrosine ont été élues en utilisant du TFA à 0,1 %. Les échantillons de peptides élués ont été dessalés à l'aide de pointes C18 STAGE, séchés sous vide et conservés à -80 ° C avant l'analyse LC-MS. À partir de l'écoulement continu, une quantification du protéome complet a été réalisée pour servir de référence pour les résultats du protéome pTyr.

Les peptides phosphotyrosine et les peptides non phosphorylés ont été analysés sur Orbitrap Fusion Lumos Tribrid (Thermo Scientific, San Jose, CA, USA) couplé au système de chromatographie liquide Easy-nanoLC 1200 nanoflow (Thermo Scientific). Les peptides de chaque fraction ont été reconstitués dans de l'acide formique à 10 % et chargés sur une colonne Acclaim PepMap100 Nano Trap (100 μm × 2 cm) (Thermo Scientific) garnie de particules C18 de 5 μm à un débit de 5 μl par minute. Les peptides ont été résolus à un débit de 250 nl/min en utilisant un gradient linéaire de 10 à 35 % de solvant B (0,1 % d'acide formique dans 95 % d'acétonitrile) pendant 95 min sur la colonne EASY-Spray (50 cm × 75 µm ID, PepMap RSLC C18 et particules de C18 de 2 µm) (Thermo Scientific) et il a été monté sur une source d'ions EASY-Spray qui fonctionnait à une tension de 2,0 kV. L'analyse par spectrométrie de masse a été effectuée de manière dépendante des données avec des balayages complets dans la plage de m/z 350 à 1500. La MS et la MS/MS ont été acquises et mesurées à l'aide de l'analyseur de masse Orbitrap. Les scans MS complets ont été mesurés à une résolution de 120 000 à m/z 200. Les ions précurseurs ont été fragmentés à l'aide d'une méthode de dissociation collisionnelle à plus haute énergie et détectés à une résolution de masse de 30 000 à m/z 200.

MaxQuant 1.5 a été utilisé pour la quantification et l'identification par rapport à une base de données de souris RefSeq (version 78) complétée par des contaminants fréquemment observés. Les paramètres de recherche utilisés sont les suivants : (a) la trypsine en tant qu'enzyme protéolytique (avec jusqu'à deux clivages manqués) ; (b) tolérance d'erreur de masse peptidique de 10 ppm; (c) tolérance d'erreur de masse de fragment de 0,02 Da ; ( d ) Carbamidométhylation de la cystéine (+ 57, 02 Da) et des étiquettes TMT (+ 229, 16 Da) sur le résidu lysine et le peptide N-terminal en tant que modification fixe et oxydation de la méthionine (+ 15, 99 Da) et phosphorylation de la sérine / thréonine / tyrosine (+ 79, 96 Da) sous forme de modifications variables. Deux clivages manqués ont été autorisés et la « correspondance entre les séries » a été activée. Les peptides et les protéines ont été filtrés à un taux de fausse découverte de 1 %. Les protéines avec une valeur q inférieure à 0,05 seront considérées comme différentiellement exprimées avec une signification statistique.

La morphologie et la fonction cardiaques ont été évaluées par échocardiographie transthoracique à l'aide d'un système haute résolution à haute fréquence (Vevo 2100, VisualSonics, Canada) équipé d'une sonde à ultrasons de 40 MHz chez des souris conscientes22,53. L'épilation mécanique et chimique du torse a été réalisée par rasage et en utilisant un agent dépilatoire disponible dans le commerce. La température centrale, contrôlée par une sonde rectale, a été maintenue entre 36,5 et 37 °C à l'aide d'une lampe chauffante. Des vues parasternales à axe long et court du cœur ont été capturées en modes B et M à des fréquences d'images optimisées. Diamètres internes VG télédiastolique (LVIDd, mm) et télésystolique (LVIDs, mm), épaisseur de la paroi télédiastolique du septum interventriculaire (IVS, mm) et de la paroi postérieure VG (LVPW, mm), fractions d'éjection VG ( EF, %) et le raccourcissement fractionnaire (FS, %) ont été mesurés à l'aide du mode M en vue grand axe. L'épaisseur relative de la paroi (RWT), une mesure de l'hypertrophie, a été calculée comme IVSd + LVPWd/LVID. Des enregistrements Doppler pulsé à l'entrée mitrale, à la sortie ventriculaire gauche et au septum basal ont été enregistrés. Les images numériques ont été stockées et analysées hors ligne à l'aide du logiciel Vevo LAB disponible dans le commerce (VisualSonics, Canada). Un technicien expérimenté en échocardiographie, aveugle aux groupes expérimentaux, a effectué toutes les mesures.

La densité des bandes a été mesurée à l'aide du logiciel ImageJ et l'aire sous la courbe correspondant aux bandes de pSRC, SRC, GAPDH, TnI et pTyr total a été calculée. Ensuite, les ratios pTyr/TnI, SRC/GAPDH, pSRC/GAPDH et pSRC/SRC ont été calculés et les ratios ont été comparés entre les groupes à l'aide d'une ANOVA unidirectionnelle.

Pour caractériser les effets de l'AG-825 sur le désordre des cardiomyocytes, nous avons utilisé l'interface utilisateur graphique Web CytoSpectre32 pour déterminer l'orientation locale des cardiomyocytes à travers les coupes histologiques. Dans des régions choisies au hasard, la variance circulaire de l'angle d'orientation moyen des myocytes a été calculée. La comparaison statistique entre les groupes (Ntg + Véhicule, Ntg + AG825, TgErbB2 + Veh, TgErbB2 + AG825) a été réalisée avec une ANOVA unidirectionnelle.

L'analyse statistique de l'ensemble de données sans étiquette a été réalisée à l'aide du logiciel Perseus54. Les peptides avec moins de 50% de détection ont été filtrés, et les valeurs manquantes des intensités des peptides rappelant ont été remplies avec les k plus proches voisins. Ensuite, les intensités log2 ont été normalisées par la soustraction médiane, l'ANOVA et les calculs du taux de fausses découvertes. Une carte thermique a été utilisée pour visualiser le regroupement hiérarchique non supervisé des protéines avec une valeur p <0, 05 par test ANOVA. Pour l'analyse statistique des données protéomiques marquées au TMT collectées, nous avons suivi le flux de travail de Foster et al.21, avec quelques modifications. Tout d'abord, le logiciel Partek a été utilisé pour calculer les valeurs p, les valeurs q, le changement de pli et le rapport de chaque intensité peptidique. Les phosphosites avec moins de 50% de valeurs de densité manquantes ont été soumis à une analyse statistique, et les valeurs manquantes de rappel ont été remplies avec les k plus proches voisins. Ensuite, une normalisation des densités Log2 par soustraction médiane et a déterminé le changement de pli, le rapport et la signification statistique (valeurs q et p), à partir de chacun des phosphosites sélectionnés de l'ensemble de données. Les tracés des volcans ont été réalisés avec GraphPad Prism 7®. L'ACP non supervisée a été utilisée séparément dans les deux ensembles de données avec le logiciel Partek®. L'ensemble de données a été séparé avec chaque composant concernant l'abondance de pTyr (normalisée, moyenne = 0, variance = 1).

La normalisation au protéome complet effectuée par soustraction d'intensité log2 a été effectuée, suivie d'un test t bilatéral et du calcul modéré des valeurs p et q à l'aide d'un algorithme développé par Herbrich et al.55 ; Le logiciel R a été utilisé pour cette analyse.

La valeur p hypergéométrique a été utilisée pour identifier les processus significativement enrichis dans les protéines et les phosphosites qui sont phosphorylés de manière différentielle entre les échantillons de cas et de contrôle. À cette fin, MsigDB23 a été utilisé pour analyser les voies au niveau des protéines et PTMsigDB24 pour analyser les processus au niveau du site. La population/le fond pour lequel l'enrichissement est calculé est limité à toutes les protéines dans lesquelles leurs sites sont quantifiés dans l'expérience de phosphoprotéomique, plutôt qu'à toutes les protéines/phosphosites universellement connues.

La KSEA cherche à identifier les kinases dont les cibles présentent des niveaux de phosphorylation significativement modifiés dans une condition donnée. KSEA note chaque kinase k avec un ensemble de substrats S comme suit :

où \({\bar{P}}_{S}\) désigne le log2 moyen du changement de pli de tous les substrats de la kinase k, et \(\bar{P}\) et σ représentent la moyenne et la norme écart de log2 du changement de pli de tous les phosphosites identifiés dans l'ensemble de données. KSEA a été effectué sur les modules identifiés en limitant S aux substrats du module au lieu de tous les substrats de l'ensemble de données. Les données fournies par PhosphoSitePLUS30 ont servi de référence pour les associations kinase-substrat. Cet outil est disponible sur le site Web du Dr M. Ayati : https://faculty.utrgv.edu/marzieh.ayati/software.html

Tout d'abord, des réseaux ont été créés dans lesquels les nœuds représentent les protéines et les bords représentent le PPI obtenu à partir de BioGRID22,56. Les protéines ont reçu un score dans les réseaux en calculant le changement de pli moyen des phosphosites résidant sur chaque protéine obtenue à partir d'expériences individuellement (c'est-à-dire Ntg, TgErbB2 et R403Q-αMyHC Tg). Ensuite, MoBaS22 a été appliqué pour identifier des sous-réseaux de protéines hautement connectées et différentiellement phosphorylées. Pour la visualisation des sous-réseaux, les protéines sont colorées en fonction du changement de pli moyen de cette protéine dans différentes conditions. Si une protéine dans un jeu de données n'est pas identifiée dans un autre jeu de données, le nœud est représenté en gris.

Une ANOVA unidirectionnelle a été utilisée pour comparer les différences entre les groupes afin d'analyser les données d'échocardiographie. Pour l'effet des traitements AG-825 ou véhicule, le traitement pré-post, nous avons utilisé un test t.

Les expériences ont été menées en répétitions (voir la section "Méthodes"). Mascot (version 2.3) a été utilisé pour l'identification des peptides à partir des données brutes MS et MaxQuant (version 1.5) a été utilisé pour la quantification. L'analyse statistique a été effectuée à l'aide de R (version 4.0), Partek Genomics Suit (version 7.0), GraphPad Prism 7.0 et Perseus (version 1.5). Des détails supplémentaires sur le traitement des données sont décrits dans la section "Méthodes".

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports de recherche sur la nature lié à cet article.

Les données de protéomique de spectrométrie de masse ont été déposées auprès du consortium ProteomeXchange via le référentiel partenaire PRIDE57 avec l'identifiant de jeu de données PXD036506. Les données supplémentaires 1 contiennent la source numérique des graphiques présentés dans les Fig. 1 et 7. La Fig. 6 supplémentaire contient les Western blots non recadrés de la Fig. 1.

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Le projet décrit a été soutenu par Grant Number K01-HL13368-01 à GARC, 5 T32 HL 7227-43, T32HL125239-05, T32HD044355 de NIH, R01 HL63038, R01 HL114910-01 et AHA 15GRNT25720026 à AMM, R01 HL13 691 à NP, R01 HL088649 à KG et R01LM012980 à MA Son contenu relève de la seule responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement les vues officielles du NIH. Nous remercions le Dr Leslie Leinwand d'avoir facilité les souris transgéniques R403Q-αMyHCTg. La Fondation nationale des sciences de Chine (81870364) et la Fondation de recherche pour le développement scientifique du district de Longgang à Shenzhen (LGKCYLW2021000020) et la Fondation des sciences naturelles de la province chinoise du Guangdong (2022A1515012468) ont soutenu MX

Ces auteurs ont contribué à parts égales : Mingguo Xu, Kevin C. Bermea, Marzieh Ayati.

Département de pédiatrie/Division de cardiologie, École de médecine de l'Université Johns Hopkins, Baltimore, MD, États-Unis

Mingguo Xu, Kevin C. Bermea, Amir Heravi, Allen D. Everett, Anne M. Murphy et Genaro A. Ramirez-Correa

Département de pédiatrie, Hôpital du troisième peuple du district de Longgang, Shenzhen, 518115, Chine

Mingguo Xu

Département d'informatique/Collège d'ingénierie et d'informatique, Université du Texas Rio Grande Valley School of Medicine, Édimbourg, Texas, États-Unis

Marzieh Ayati

Département de neurologie/Institut de génie cellulaire, École de médecine de l'Université Johns Hopkins, Baltimore, MD, États-Unis

Cliquez sur Télécharger pour enregistrer Han Byeol Kim - Chan Hyun Na mp3 youtube com

Département d'anesthésiologie, Hôpital Qilu, Cheeloo College of Medicine, Université du Shandong, Ji'nan, Chine

Xiaomei Yang

Département des sciences moléculaires/UT Health Rio Grande Valley, McAllen, TX, États-Unis

Andres Medina et Genaro A. Ramirez-Correa

Département de pédiatrie/Division d'hématologie, École de médecine de l'Université Johns Hopkins, Baltimore, MD, États-Unis

Zongming Fu

Département de cardiologie, Hôpital Qilu, Cheeloo College of Medicine, Université du Shandong, Ji'nan, Chine

Xinyu Zhang

Département de chimie biologique/McKusick-Nathans Institute of Genetic Medicine, Johns Hopkins University School of Medicine, Baltimore, MD, États-Unis

Chan Hyun Na

Département de pathobiologie moléculaire et comparée, Johns Hopkins University School of Medicine, Baltimore, MD, États-Unis

Kathleen Gabrielson

Département de médecine/Division de cardiologie, École de médecine de l'Université Johns Hopkins, Baltimore, MD, États-Unis

D. Brian Foster & Nazareno Paolocci

Département des sciences biomédicales, Université de Padoue, Padoue, Italie

Nazaréen Paolocci

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MX, AM, HBK, XY, XF, AH, XZ et CHN ont effectué des expériences et des analyses de données, AE, KG, DBF et NP ont fourni un soutien statistique et un examen critique, KCB, MA ont fourni un soutien bioinformatique et statistique, MX, KCB, NP, AMM et GARC ont rédigé le manuscrit, AMM et GARC ont conçu l'étude et supervisé les travaux.

Correspondance à Anne M. Murphy ou Genaro A. Ramirez-Correa.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Communications Biology remercie Brian Delisle et les autres examinateurs anonymes pour leur contribution à l'examen par les pairs de ce travail. Rédacteurs en chef de la manipulation principale : Tami Martino et Joao Manuel de Sousa Valente. Les rapports des pairs examinateurs sont disponibles.

Note de l'éditeur Springer Nature reste neutre en ce qui concerne les revendications juridictionnelles dans les cartes publiées et les affiliations institutionnelles.

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Réimpressions et autorisations

Xu, M., Bermea, KC, Ayati, M. et al. L'altération de la phosphorylation de la tyrosine du protéome cardiaque et de la voie EGFR contribue à la cardiomyopathie hypertrophique. Commun Biol 5, 1251 (2022). https://doi.org/10.1038/s42003-022-04021-4

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Reçu : 09 novembre 2020

Accepté : 22 septembre 2022

Publié: 15 novembre 2022

DOI : https://doi.org/10.1038/s42003-022-04021-4

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