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Virology Journal volume 19, Article number: 130 (2022) Citer cet article

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À l'heure actuelle, il n'existe toujours pas de médicaments thérapeutiques spécifiques et de vaccins appropriés pour la Dengue. Par conséquent, il est important d'explorer des indicateurs de diagnostic clinique distincts.

Dans cette étude, nous avons combiné l'analyse des gènes différentiellement exprimés (DEG), l'analyse pondérée du réseau de co-expression (WGCNA) et la courbe caractéristique du récepteur opérateur (ROC) pour dépister un biomarqueur stable et robuste avec une valeur diagnostique pour les patients atteints de dengue. CIBERSORT a été utilisé pour évaluer le paysage immunitaire des patients atteints de dengue. L'enrichissement de l'ontologie génétique (GO), l'analyse de l'Encyclopédie des gènes et des génomes de Kyoto (KEGG) et l'analyse de l'enrichissement de l'ensemble de gènes (GSEA) ont été appliquées pour explorer les fonctions potentielles des gènes centraux.

Les cellules CD38 et plasma ont une excellente aire sous la courbe (AUC) pour distinguer les stades cliniques des patients atteints de dengue, et les cellules T CD4 + mémoire activées et les monocytes ont une bonne ASC pour cette fonction. Le ZNF595 a une ASC acceptable pour distinguer la dengue hémorragique (DHF) de la dengue (DF) à tous les stades aigus. En analysant n'importe quel sérotype, nous pouvons obtenir des résultats cohérents. L'inhibition négative de la réplication virale basée sur les résultats d'analyse GO, KEGG et GSEA, les gènes d'autophagie régulés à la hausse et l'altération du système immunitaire sont des raisons potentielles entraînant la DHF.

Le CD38, les cellules plasmatiques, les lymphocytes T CD4+ à mémoire activée et les monocytes peuvent être utilisés pour distinguer les stades cliniques des patients atteints de dengue, et le ZNF595 peut être utilisé pour distinguer le DHF du DF, quels que soient les sérotypes.

La dengue a été classée par l'Organisation mondiale de la santé (OMS) parmi les dix principales menaces sanitaires mondiales annoncées début 2019 [1]. Au cours des dernières décennies, la dengue est devenue la maladie transmise par les moustiques à la croissance la plus rapide dans le monde [2,3,4], mettant gravement en danger la santé humaine [5, 6]. La recherche et le développement de vaccins continuent de progresser [7,8,9,10,11,12], mais le renforcement dépendant des anticorps (ADE) limite l'efficacité des vaccins [13,14,15,16,17]. Les infections asymptomatiques augmentent l'incidence de la dengue [16, 18] et des traitements efficaces n'ont pas été identifiés. Par conséquent, il est urgent d'explorer le mécanisme pathogène de la dengue et de filtrer les marqueurs moléculaires pour un meilleur diagnostic et des traitements.

L'autophagie, un processus catabolique qui dégrade les composants intracellulaires endommagés ou anormaux pour récupérer les nutriments, est essentielle au maintien de l'homéostasie cellulaire et corporelle [19, 20], et profite à la prolifération et à l'infection du virus de la dengue (DENV) [21,22,23, 24]. Dans l'infection par DENV-ADE, les anticorps à réaction croisée médient l'infection en induisant des protéines liées à l'autophagie, puis suppriment l'immunité innée médiée par la protéine antivirale mitochondriale (MAVS) [25]. La réponse immunitaire affecte directement ou indirectement la réponse de l'hôte au DENV à des degrés divers, y compris l'infection symptomatique, l'infection asymptomatique [26, 27], le syndrome de choc de la dengue (DSS) et la dengue hémorragique (DHF) [28,29,30]. Par conséquent, il est essentiel d'explorer l'autophagie et la réponse immunitaire lors de l'infection par le DENV.

Les recherches en transcriptomique sont bénéfiques pour aider les chercheurs à mieux comprendre les causes des maladies [31] et à localiser les biomarqueurs [32,33,34]. Nos précieuses recherches en transcriptomique ont contribué à comprendre l'évolution virale et son impact sur la pathogénicité et le développement de vaccins contre le DENV [35,36,37,38]. Cependant, les études [39, 40, 41] publiées se sont concentrées sur des recherches multi-gènes et une méthode analytique unique (analyses de gènes différentiellement exprimés (DEG)) et n'ont pas établi de lien entre la génomique et les paysages immunitaires. Dans cette étude, nous avons utilisé une combinaison d'analyses DEG, d'analyse de réseau de co-expression pondérée (WGCNA) et de courbe caractéristique récepteur-opérateur (ROC) pour identifier, valider et tester des biomarqueurs avec une valeur diagnostique des stades et de la gravité dans des ensembles de données indépendants, et appliqué le Site Web CIBERSORT pour analyser les différences de paysage immunitaire entre trois stades et entre la DHF et la dengue (DF) et explorer les corrélations entre les gènes et les cellules immunitaires.

Les ensembles de données d'expression génique des patients atteints de dengue ont été sélectionnés à partir d'une base de données publique appelée les bases de données Gene Expression Omnibus (GEO, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo). Nous avons suivi ces points de référence : 1. les ensembles de données ont analysé des échantillons de sang total de différents stades de patients atteints de dengue, y compris DF et DHF, et des échantillons normaux ; 2. Les ensembles de données doivent inclure au moins 20 patients atteints de dengue. Sur la base de ces critères, nous avons obtenu l'ensemble de données GSE43777 analysant deux types de puces (affymetrix HG-U133 plus 2 dans la plate-forme GLP570 et HG-Focus dans la plate-forme GLP201) [41], l'ensemble de données GSE28405 [42] et l'ensemble de données GSE51808 [43].

Dans GSE43777, plus de 200 échantillons (un échantillon pour chaque étape) ont été collectés auprès de 51 sujets DF et 13 sujets DHF à Maracay, au Venezuela, et les caractéristiques démographiques et cliniques, immunologiques et hématologiques des participants ont été précieusement résumées [41]. Dans GSE28405, 31 échantillons de patients positifs à la DENV RT-PCR cliniquement indifférenciés ont été sélectionnés à Singapour dans les 72 h (stade aigu précoce, EA), 4 à 7 jours (stade aigu tardif, LA) et 3 à 4 semaines (stade de convalescence, C) après l'apparition de la fièvre autodéclarée, et d'autres informations cliniques avaient été enregistrées comme précieusement décrites [42]. Dans GSE51808, des échantillons de sang total ont été prélevés sur 47 patients atteints de dengue (DF n = 31, DHF = 16) hospitalisés à l'hôpital Siriraj de Bangkok dans les jours 2 et 4 semaines ou plus après la sortie (stade de convalescence) et 9 sujets normaux ont été analysés, et des informations cliniques détaillées ont également été montrées [44].

En ce qui concerne les niveaux d'expression génique aux stades C ou EA comme valeurs de référence, ces patients ont été divisés en 3 groupes, C vs EA, C vs LA et EA vs LA, comme études précieuses [41]. L'analyse en composantes principales (ACP) [45] a été utilisée pour déterminer si les différentes étapes peuvent être clairement distinguées.

Un site Web (http://sangerbox.com/Tool) basé sur un package R "Limma" a été appliqué pour analyser les DEG parmi trois phases (nous avons montré l'analyse indépendamment des sérotypes et avons également effectué une analyse séparée pour chaque sérotype) et entre DHF et DF pour les patients atteints de dengue. Le package AR "clusterProfiler" dans R version 4.1.0 et un logiciel d'analyse d'enrichissement d'ensemble de gènes (GSEA) (4.1.0) [46] ont été utilisés pour effectuer une analyse d'enrichissement Gene Ontology (GO), Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) analyse et GSEA pour explorer les bio-fonctions potentielles et les voies d'enrichissement pour les DEG.

Nous avons obtenu un total de 4843 gènes dans le groupe C vs EA, 4472 gènes dans le groupe C vs LA et 4463 gènes dans le groupe EA vs LA par un package "WGCNA". Nous avons converti la matrice d'adjacence en matrice de chevauchement topologique (TOM) lorsque la puissance de β était égale à 5, 4 et 12. Selon un seuil de hauteur de 0,25, nous avons fusionné les modules similaires et le module affichant la plus grande conformité avec la maladie du développement de la dengue a été utilisé pour croiser les DEG afin d'identifier des DEG plus stables.

nous avons estimé les fractions de cellules immunitaires dans des échantillons de sang total par le site Web "CIBERSORT" (https://cibersortx.stanford.edu/index.php) qui peut être utilisé pour saisir des données d'expression génique, puis obtenir une estimation de fraction de 22 cellules immunitaires types dans les échantillons de sang total [48].

Le ROC [49] a été appliqué pour identifier, valider et tester la valeur des biomarqueurs et des cellules immunitaires en distinguant les stades et la gravité en fonction de l'aire sous la courbe (AUC).

Les logiciels R (version 4.1.0) et R. Studio (version 1.9.0) ont été utilisés pour analyser les données et visualiser les résultats. Nous avons appliqué le test t, le test U de Mann-Whitney et le test du chi carré pour identifier les différences entre les deux groupes. Des analyses de corrélation ont été présentées selon les théories de Pearson et Spearman. Les valeurs P < 0,05 ont été considérées comme une signification statistique.

La figure 1 montre une illustration pour cette étude.

Diagramme d'organigramme. Les niveaux d'expression d'ARN dans les cellules mononucléaires du sang périphérique (PBMC) des patients atteints de dengue changeront au cours de l'infection par le virus de la dengue (DENV). Nous avons téléchargé ces données de séquence d'ARN et ces informations cliniques à partir de l'ensemble de données du National Center of Biotechnology Information (NCBI) (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/). En combinant le package R "Limma" avec "WGCNA", des gènes stables à expression différentielle (DEG) parmi trois phases et entre DHF et DF pour les patients atteints de dengue ont été criblés et nous avons également exploré les fonctions potentielles de ces DEG à l'aide de Gene Ontology (GO), Kyoto Encyclopedia of Analyse des gènes et des génomes (KEGG) et analyse de l'enrichissement de l'ensemble de gènes (GSEA). Sur la base des données d'expression génique, les fractions de cellules immunitaires dans les échantillons de sang total ont été estimées par le site Web "CIBERSORT" et les corrélations entre les cellules immunitaires et les gènes huh ont également été qualifiées. Enfin, nous avons utilisé l'aire sous la courbe (AUC) pour évaluer la valeur diagnostique des gènes huh et des cellules immunitaires importantes pour distinguer les stades cliniques et la gravité

L'analyse en composantes principales (ACP) montre que les échantillons à trois étapes peuvent être distingués (fichier supplémentaire 1 : Figure S1 A–C). Après avoir normalisé les données d'expression de l'ensemble de données GSE43777 sur la plate-forme GLP201, nous identifions 147 DEG (121 gènes régulés positivement et 26 gènes régulés négativement) entre les stades C et EA (Fig. 2A, F et fichier supplémentaire 7 : Tableau S1) , 124 DEG (102 gènes régulés positivement et 22 gènes régulés négativement) entre les stades C et LA (Fig. 2B, G et fichier supplémentaire 8 : Tableau S2) et 195 DEG (74 gènes régulés positivement et 121 gènes régulés négativement). gènes régulés) entre les stades EA et LA (Fig. 2C, H et Fichier complémentaire 9 : Tableau S3) par un package "Limma" basé sur |Log2FC|≥ 1, et valeur P ajustée < 0,05. De même, au stade EA, nous avons obtenu 30 DEG (16 gènes régulés positivement et 14 gènes régulés négativement) (Fig. 2D, I et Fichier supplémentaire 10 : Tableau S4) entre DF (n = 15) et DHF (n = 11 ) échantillons de l'ensemble de données GSE43777 sur la plate-forme GLP570 et 58 DEG (48 gènes régulés positivement et 10 gènes régulés négativement) (Fig. 2E, J et fichier supplémentaire 11 : Tableau S5) entre DF (n = 25) et DHF (n = 26) échantillons au stade LA, sur la base de |Log2FC|≥ 1 et valeur P < 0,05.

Les cartes des volcans A – E et les cartes thermiques F – J filtrent les gènes exprimés de manière différentielle (DEG). L'analyse K – O Gene Ontology (GO) montre que les gènes exprimés de manière différentielle (DEG) sont principalement impliqués dans les processus biologiques et l'analyse P – T Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) affiche les voies d'enrichissement potentielles des DEG. (C, stade de convalescence ; EA, stade aigu précoce ; LA, stade aigu tardif)

Les résultats de l'analyse d'enrichissement GO montrent que 147 DEG (entre les stades C et EA) sont principalement enrichis en réponse de défense aux virus et à l'interféron de type I (Fig. 2K); La réplication de l'ADN est une bioactivité courante pour les 124 DEG (entre les stades C et LA) (Fig. 2L); la figure 2M montre que l'activation des neutrophiles et la réponse de défense contre le virus dominent les biofonctions d'enrichissement pour 195 DEG entre les stades EA et LA ; les bio-fonctions impliquées dans la régulation négative de la réplication du génome viral sont plus actives pour 30 degrés entre les échantillons DF et DHF sur la figure 2N ; les réponses immunitaires neutrophiles et humorales sont activées pour les échantillons DHF au stade LA (Fig. 2O).

Les résultats de l'analyse d'enrichissement GO (gènes régulés à la baisse dans des échantillons DHF enrichis en régulation négative de la réplication virale) sur les Fig. 2I et N ont attiré notre attention, car ils suggéraient qu'il était difficile de contrôler la réplication virale chez les patients DHF au stade EA. Des études relatives [21, 24, 50] ont démontré que le DENV inhibait l'apoptose cellulaire par autophagie, favorisant ainsi sa réplication. Par conséquent, nous soupçonnons que les gènes d'autophagie liés peuvent être activés au stade EA et au stade LA. Comme le montre le fichier supplémentaire 1: Figure S1 J, au stade LA, nous identifions définitivement 1 gène d'expression différent lié à l'autophagie (CCL2) en croisant les DEG entre les échantillons DHF et DH de GSE43777 analysés sur la plate-forme GLP570 avec 222 gènes liés à l'autophagie téléchargés de Human Autophagy Database (HADb) qui fournit une liste complète et à jour des gènes et protéines humains impliqués directement ou indirectement dans l'autophagie. Le diagramme de boîte à moustaches (Fichier supplémentaire 1 : Figure S1 K) montre que les niveaux d'expression de CCL2 augmentent de manière significative dans les échantillons DHF au stade LA, ce qui suggère que le DENV se réplique plus fortement dans le DHF que dans le DF, ce qui peut être l'une des raisons entraînant le DHF dans le LA. organiser. Bien que nous n'identifiions pas d'expression différente des gènes liés à l'autophagie entre DF et DHF au stade EA.

Les résultats de l'analyse KEGG révèlent que l'infection par un agent pathogène et la voie de signalisation du récepteur de type NOD - sont des voies d'enrichissement évidentes pour les 147 DEG (entre les stades C et EA) (Fig. 2P); La réplication cellulaire, la légionellose et le paludisme sont des voies d'enrichissement majeures pour les 124 DEG (entre les stades C et LA) (Fig. 2Q) ; 195 DEG (entre les stades EA et LA) sont enrichis en infection pathogène et en réplication cellulaire (Fig. 2R); NOD - comme la voie de signalisation des récepteurs et l'infection par un agent pathogène sont plus actifs pour 30 DEG entre les échantillons DF (n = 15) et DHF (n = 11) sur la figure 2S; les voies inflammatoires sont activées pour les échantillons DHF au stade LA sur la figure 2T.

En utilisant le jeu de données GSE43777 analysé sur la plateforme GLP201, nous avons réalisé un package "WGCNA" pour obtenir des modules clés associés aux caractéristiques de procession de la Dengue. Nous sélectionnons respectivement 5, 4 et 12 (Fig. 3A – C) comme puissance de seuil souple et 0,25 (Fichier supplémentaire 1 : Figure S1 DF) comme hauteur de coupure dans le groupe C vs EA, dans le groupe C vs LA et dans le groupe EA vs LA. Les modules sont constitués de gènes ayant des propriétés d'expression similaires (Fichier supplémentaire 1 : Figure S1 G–I). Dans l'arbre de cluster, nous utilisons chaque branche pour représenter un gène et une couleur pour montrer un module de co-expression (Fig. 3D – F).

Analyse pondérée du réseau de co-expression (WGCNA). A – C L'indice d'ajustement sans échelle (à gauche) et la connectivité moyenne (à droite) de différentes puissances de seuil souple. D – F Clustering dendrogrammes de gènes. Les cartes thermiques G – I des corrélations d'affichage des traits de module entre les différentes étapes. (C, stade de convalescence ; EA, stade aigu précoce ; LA, stade aigu tardif)

L'association des valeurs du module propre du gène (ME) et des stades cliniques est appliquée pour évaluer la corrélation des caractéristiques module-stade. Les résultats du WGCNA montrent respectivement 14, 12 et 8 modules (Fig. 3G – I). Comparé au groupe C avec le groupe EA, le module turquoise est le plus fortement apparié avec le groupe EA (coefficient de Pearson = − 0,89, P = 1e−33) et le groupe C (coefficient de Pearson = 0,89, P = 1e -33) sur la figure 3G. Comparé au groupe C avec le groupe LA, la corrélation la plus significative peut être observée entre le groupe LA (coefficient de Pearson = 0,71, P = 5e−20) et le module bleu, et entre le groupe C (coefficient de Pearson = − 0,71, P = 5e−20) et le module bleu de la Fig. 3H. En comparant le groupe LA avec le groupe EA, le module noir et le module vert montrent la même corrélation la plus élevée (coefficient de Pearson = 0,72) sur la Fig. 3I. Nous considérons ces modules mentionnés ci-dessus comme des modules clés.

Pour filtrer avec précision les gènes hub fiables et forts (gènes partagés), des diagrammes de Venn ont été utilisés pour visualiser les gènes hub entre les DEG et les modules clés par un site Web (http://www.ehbio.com/test/venn/#/) [51] . Les résultats illustrent 143, 99 et 187 gènes hub en interagissant le module turquoise avec 147 DEG (entre les stades C et EA) (Fig. 4A), en interagissant avec le module bleu avec 124 DEG (entre les stades C et LA) ( Fig. 4B), interagissant les modules noir et vert avec 195 DEG (entre les étages EA et LA) (Fig. 4C), respectivement. CD38 et CDKN1C sont partagés par les trois phases (Fig. 4D). Lors de l'examen des sérotypes, CD38 et CDKN1C s'expriment toujours différemment dans trois groupes de comparaison (C vs EA, C vs LA, EA vs LA) pour chaque sérotype et log|FC|> 1 ou log|FC| est extrêmement proche de 1 (Fichier complémentaire 12 : Tableau S6). La Fig. 4G montre que les niveaux d'expression de CD38 augmentent d'abord puis diminuent du jour 0 au stade C (*** P < 0,001). Alors que l'expression de CDKN1C est d'abord régulée à la baisse puis régulée à la hausse du jour 0 au stade C (*** P <0, 001) (Fig. 4G). La GSEA montre que CD38 est enrichi dans la prolifération des caves et les voies métaboliques (Fig. 4E) et CDKN1C est enrichi dans le métabolisme des lipides et les voies de l'inflammation (Fig. 4F). Les analyses de corrélation montrent à la Fig. 4H que les niveaux d'expression de CD38 sont négativement corrélés avec CDKN1C (corrélation de Spearman = - 0, 5). Nous sélectionnons CD38 et CDKN1C pour les analyses de suivi.

Les diagrammes de Venn éliminent les gènes partagés : A 143 gènes partagés entre le module turquoise et les gènes exprimés de manière différentielle (DEG) (entre le stade C et le stade EA) ; Gènes partagés B 99 entre le module bleu et les DEG (entre le stade C et le stade LA) ; Gènes partagés C 187 entre le module noir et vert et les DEG (entre le stade EA et le stade LA); D 2 partageait des gènes entre trois stades. E et F montrant les voies potentielles d'enrichissement des fonctions pour CD38 et CDKN1C par analyse d'enrichissement d'ensemble de gènes (GSEA). G La boîte à moustaches montrant les changements dans les niveaux d'expression de CD38 et CDKN1C au fil du temps (***P < 0,001). Corrélation négative HA entre CD38 et CDKN1C. (C, stade de convalescence ; EA, stade aigu précoce ; LA, stade aigu tardif)

Étant donné que CD38 et CDKN1C s'expriment différemment en trois étapes (Fig. 5A – B), nous supposons qu'ils peuvent être utilisés comme biomarqueurs avec une caractéristique de mise en scène pour distinguer les stades cliniques des patients atteints de dengue. Pour identifier, vérifier et tester la valeur de CD38 et CDKN1C, nous considérons les jeux de données GSE43777 analysés sur la plateforme GPL201 (stade C, n = 48 ; stade EA, n = 47 ; stade LA, n = 73), les jeux de données GSE43777 analysés sur la plateforme Plateforme GPL570 (stade C, n = 24 ; stade EA, n = 26 ; stade LA, n = 51) et GSE28405 (stade C, n = 31 ; stade EA, n = 57 ; stade LA, n = 31) en tant que ensemble de données d'apprentissage, un ensemble de données de vérification et un ensemble de données de test, respectivement. Lors de l'analyse d'un seul sérotype, nous considérons les ensembles de données GSE43777 analysés sur la plateforme GPL201 (sérotype I : stade C, n = 26 ; stade EA, n = 26 ; stade LA, n = 44. Sérotype II : stade C, n = 6 ; EA stade, n = 7 ; stade LA, n = 5. sérotype III : stade C, n = 9 ; stade EA, n = 9 ; stade LA, n = 15. Sérotype IV : stade C, n = 6 ; stade EA, n = 4 ; stade LA, n = 8.), jeux de données GSE43777 analysés sur la plate-forme GPL570 (Sérotype I : stade C, n = 7 ; stade EA, n = 3 ; stade LA, n = 14. Sérotype II : stade C , n = 11 ; stade EA, n = 16 ; stade LA, n = 23. sérotype III : stade C, n = 3 ; stade EA, n = 3 ; stade LA, n = 8. Sérotype IV : stade C, n = 3 ; stade EA, n = 3 ; stade LA, n = 6.) en tant qu'ensemble de données d'apprentissage et ensemble de données de vérification, respectivement.

A et B Niveaux d'expression significativement différents de CD38 et CDKN1C en trois étapes. C CD38 et CDKN1C peuvent être utilisés pour distinguer les échantillons de dengue des échantillons normaux. Analyse de la valeur de diagnostic de stadification de CD38 et CDKN1C pour la dengue par aire sous la courbe (AUC) : D–F analysé d'abord dans le groupe de formation, G–I vérifié ensuite dans le groupe de vérification, J–L testé enfin dans le groupe de test. (C, stade de convalescence ; EA, stade aigu précoce ; LA, stade aigu tardif)

Dans le groupe de formation, CD38 a 0,960, 0,976 et 0,829 d'AUC dans trois groupes de comparaison (C vs EA, C vs LA, EA vs LA) respectivement et CDKN1C a 0,852, 0,868 et 0,955 d'AUC dans trois groupes de comparaison (C vs EA, C contre LA, EA contre LA) respectivement (Fig. 5D–F). Dans le groupe de vérification, la valeur diagnostique de stadification de CD38 et CDKN1C dans la stadification de la dengue est la suivante (Fig. 5G – I) : CD38 (AUC : 0,897, C vs EA ; AUC : 0,957, C vs LA ; AUC : 0,827, EA contre LA), CDKN1C (AUC : 0,575, C contre EA ; AUC : 0,929 C contre LA ; AUC : 0,876, EA contre LA). La figure 5J–L montre des valeurs diagnostiques élevées dans l'ensemble de données de test : CD38 (AUC : 0,822, C vs EA ; AUC : 0,996 C vs LA ; AUC : 0,926, EA vs LA), CDKN1C (AUC : 0,744, C vs EA ; AUC : 0,724 C contre LA ; ASC : 0,842, EA contre LA). Les résultats analytiques ci-dessus montrent que CD38 peut distinguer des phases admirablement différentes pour les patients atteints de dengue et a une valeur de distinction plus élevée que CDKN1C. Bien que nous considérions les sérotypes (sérotypes I à IV), les résultats sont similaires parmi les trois groupes de comparaison (C vs EA, C vs LA, EA vs LA) (Fichier supplémentaire 2 : Figure S2, Fichier supplémentaire 3 : Figure S3).

De plus, comme le montre la figure 5C, CD38 distingue parfaitement les échantillons de dengue des échantillons normaux avec une AUC de 100 % dans l'ensemble de données GSE51808 (9 échantillons normaux et 28 échantillons de dengue). Par conséquent, CD38 montre la valeur élevée des stades distinctifs pour les patients atteints de dengue. Nous avons sélectionné CD38 comme biomarqueur pour la stadification du diagnostic de la dengue.

Il n'y a pas de différence significative dans les niveaux d'expression de CD38 et CDKN1C entre les échantillons DH et DHF (Fichier supplémentaire 1 : Figure S1 L), et différents sérotypes de dengue ne montrent pas non plus de différence évidente dans les niveaux d'expression de CD38 et CDKN1C (Fichier supplémentaire 1 : Figure S1 M).

Après avoir croisé 30 DEG entre les échantillons DF (n = 15) et DHF (n = 11) de l'ensemble de données GSE43777 sur la plate-forme GLP570 au stade EA avec 58 DEG entre les échantillons DF (n = 25) et DHF (n = 26) dans le LA stade, nous identifions 6 DEG partagés (LOC101928288, TCN1, DEFA4, FRG1B, LOC286087 et ZNF595) (Fig. 6A). Nous supposons que LOC101928288, TCN1, DEFA4, FRG1B, LOC286087 et ZNF595 peuvent être utilisés comme biomarqueurs pour distinguer les patients DHF des patients DF en raison de leur expression différente entre DHF et DF. L'analyse du jeu de données GSE43777 sur la plate-forme GPL570 au stade EA (DF = 15 ; DHF = 11) (Fig. 6B) et au stade LA (DF = 25 ; DHF = 26) (Fig. 6C) est considérée comme une formation base de données; L'ensemble de données GSE43777 analysé sur la plate-forme GPL201 au stade aigu (DF = 40 ; DHF = 37) est considéré comme un ensemble de données de vérification ; Les jeux de données GSE51808 (DF = 18 ; DHF = 10) et GSE18090 (DF = 8 ; DHF = 10) sont considérés comme des jeux de données de test. Les résultats ROC (Fig. 6B – F) montrent que ZNF595 a toujours une valeur diagnostique acceptable pour distinguer les patients DHF des patients DF. Par conséquent, ZNF595 est sélectionné comme biomarqueur pour prédire les patients DHF aux stades aigus.

A Gènes différentiellement exprimés (DEG) partagés entre la dengue (DF) et la dengue hémorragique (DHF) au stade aigu. Analyse de la valeur de diagnostic de LOC101928288, TCN1, DEFA4, FRG1B, LOC286087 et ZNF595 pour la gravité de la dengue par zone sous la courbe (AUC) : B–C dans l'ensemble de données de formation, D dans l'ensemble de données de vérification, E–F dans les ensembles de données de test. (C, stade de convalescence ; EA, stade aigu précoce ; LA, stade aigu tardif)

Les analyses d'enrichissement GO pour 58 DEG entre les échantillons DHF et les échantillons DF montrent que la réponse immunitaire neutrophile et humorale est activée et les analyses d'enrichissement de la voie KEGG montrent de riches voies inflammatoires. Par conséquent, nous analysons les changements de fraction pour 22 types de cellules immunitaires lors d'une infection au DENV par CIBERSORT. L'analyse de l'ensemble de données GSE43777 sur la plate-forme GLP201 est utilisée pour explorer des fractions de 22 types de cellules immunitaires dans des échantillons de sang total de patients atteints de dengue en trois phases et l'ensemble de données GSE43777 analysé sur la plate-forme GLP570 est appliqué pour explorer différemment les caractéristiques immunitaires infiltrantes entre DF et Échantillons DHF.

Comme le montrent les Fig. 7A – C et 7F, dans la phase EA, les fractions de cellules dendritiques activées, les neutrophiles, les monocytes et les macrophages M1 (P <0, 05) augmentent de manière significative par rapport aux phases LA et C. Par rapport à la phase LA avec la phase EA et la phase C, les fractions de plasmocytes et de lymphocytes T CD4 + mémoire activés (P <0, 05) augmentent clairement (Fig. 7A – C et F). Par rapport à la phase EA et à la phase LA, les augmentations des fractions de cellules B mémoire, de cellules T CD4 + mémoire au repos, de cellules dendritiques au repos, d'éosinophiles et de cellules B naïves (P <0, 05) sont plus évidentes dans la phase C (Fig. 7A–C et F). Les résultats analytiques ci-dessus signifient que les cellules immunitaires avec présentation antigénique, phagocytose et chimiotaxie, les cellules immunitaires impliquées dans l'immunité humorale et les cellules mémoire sont plus manifestement actives dans les phases EA, LA et C, respectivement. Lors de l'analyse d'un seul sérotype, nous pouvons toujours obtenir les résultats ci-dessus (Fichier supplémentaire 4 : Figure S4).

Les diagrammes de violon A – E et les cartes thermiques F – H affichent les différences immunitaires des cellules immunitaires dans différents groupes de comparaison. I–J Corrélation entre les gènes (CD38 et ZNF595) et 22 types de cellules immunitaires (rectangle rouge : statistiquement significatif (P < 0,05)). (C, stade de convalescence ; EA, stade aigu précoce ; LA, stade aigu tardif)

Au stade LA, les fractions de cellules NK activées (P <0,05) augmentent dans les échantillons DHF (Fig. 7E et H), mais les fractions de cellules T CD8 +, de cellules T gamma delta, de cellules NK au repos, de macrophages M2 et de mastocytes au repos diminuent. (Fig. 7E et H) (P < 0,05), ce qui implique que la réponse immunitaire est endommagée dans les échantillons de DHF. Au stade EA, la réponse immunitaire des patients DF est similaire à celle des patients DHF (Fig. 7D et G). La réponse immunitaire des patients DHF au stade LA est significativement altérée ce qui explique la détérioration rapide des patients DHF au stade LA.

Nous analysons les corrélations entre CD38 et les cellules immunitaires dans l'ensemble de données GSE43777 (Fig. 7I). Le niveau d'infiltration des plasmocytes, des lymphocytes T CD4+ à mémoire activée, des lymphocytes T gamma delta et des lymphocytes T CD8+ est positivement lié au CD38 (Fig. 7I) ; le niveau d'infiltration des lymphocytes B naïfs, des monocytes, des cellules dendritiques au repos, des lymphocytes T CD4+ mémoire au repos, des lymphocytes T CD4+ naïfs, des lymphocytes B mémoire, des éosinophiles et des mastocytes activés est négativement lié au CD38 (Fig. 7I). Par conséquent, les résultats analytiques ci-dessus montrent qu'il existe une forte relation de co-expression entre le CD38 et les plasmocytes et entre le CD38 et les lymphocytes T CD4+ mémoire activés (corrélation de Pearson > 0,5). En sérotype individuel, on peut encore tirer cette conclusion (Fichier complémentaire 5 : Figure S5). La corrélation entre les cellules immunitaires et ZNF595 n'est pas significative (Fig. 7J).

En raison de la forte corrélation de co-expression entre CD38 et les plasmocytes, nous avons émis l'hypothèse que les plasmocytes infiltrant-immuns pourraient également montrer des différences distinctes en trois étapes. Pour explorer cette caractéristique, nous avons considéré GSE43777 analysé par GPL201 comme un ensemble d'apprentissage et GSE43777 analysé par GPL570 comme un ensemble de test. Comme le montre la Fig. 8A – C dans le groupe de formation, la valeur distinctive des cellules plasmatiques, des cellules T CD4 + mémoire activées et des monocytes en stadification était bonne et les cellules plasmatiques ont la valeur distinctive la plus élevée (AUC : 0,827, C vs EA ; AUC :0,964, C contre LA ; ASC : 0,832, EA contre LA). Dans le groupe test, la valeur distinctive de trois types de cellules immunitaires au stade de la dengue était toujours valable et les cellules plasmatiques ont la valeur distinctive la plus élevée sur la Fig. LA ; AUC : 0,824, EA vs LA. Les cellules plasmatiques (AUC = 0,968), les lymphocytes T CD4 + mémoire activés (AUC = 0,845) et les monocytes (AUC = 0,869) peuvent très bien distinguer les échantillons de dengue des échantillons normaux dans GSE51808 (Fig. 8G ). Lors de l'examen de différents sérotypes, les résultats ci-dessus ont toujours été obtenus (Fichier supplémentaire 6 : Figure S6). Par conséquent, nous pouvons discriminer trois stades en fonction de la fraction de cellules plasmatiques, de cellules T CD4 + mémoire activées et de monocytes chez les patients atteints de dengue.

Analyse de la valeur diagnostique de la stadification des cellules immunitaires pour la dengue par zone sous la courbe (AUC). A–C dans le groupe d'entraînement et D–F dans le groupe de test. G Validation de la valeur diagnostique des cellules immunitaires entre les échantillons de dengue et les échantillons normaux. (C, stade de convalescence ; EA, stade aigu précoce ; LA, stade aigu tardif)

Cette étude a combiné l'analyse DEG, WGCNA et ROC pour identifier, valider et tester les biomarqueurs potentiels associés à la stadification et à la gravité de la dengue, et a utilisé l'analyse d'enrichissement GO, l'analyse KEGG et l'analyse GSEA pour explorer les raisons potentielles de la DHF. Le site Web CIBERSORT a également été appliqué pour explorer les différences immunitaires au cours de l'infection par la dengue. Notre recherche a été la première à montrer que CD38 et ZNF595 avaient une signification clinique dans le stade et la gravité de la dengue et qu'ils pouvaient être utilisés comme biomarqueurs pour distinguer les stades cliniques et la gravité des patients atteints de dengue. Il convient de noter que les cellules plasmatiques, les cellules T CD4 + mémoire activées et les monocytes ont également montré une valeur distinctive.

Le CD38 qui a été identifié, vérifié et testé dans des ensembles de données indépendants pouvait distinguer trois stades cliniques de la dengue et était significativement associé aux plasmocytes, mais il ne pouvait pas être utilisé pour prédire la gravité qui était similaire à des résultats précieux [52] et distinguer différents sérotypes. Nos résultats ont montré que les niveaux d'expression de CD38 et les fractions de plasmocytes étaient similaires dans quatre sérotypes. Nous avons identifié, vérifié et testé le ZNF595 dans des ensembles de données indépendants qui pourraient prédire la DHF. Mécaniquement, les EA-DEG ​​qui inhibaient la réplication virale étaient régulés à la baisse dans la DHF, et un gène apparenté à l'autophagie (CCL2) s'exprimait différemment et augmentait de manière significative dans la DHF, ce qui suggérait que l'autophagie régulée par le DENV conduisait à la DHF.

De plus, nous avons analysé systématiquement les différences immunitaires entre les trois stades et entre DHF et DF au stade aigu, et la corrélation entre les cellules immunitaires et les gènes. Les résultats de l'analyse immunitaire ont montré que les fractions de monocytes, de mastocytes activés, de macrophages M1 et de neutrophiles référés à la réponse immunitaire innée augmentaient manifestement au stade EA par rapport au stade C ; des incréments significatifs peuvent être observés dans les fractions de plasmocytes et de lymphocytes T CD4+ mémoire activés comparant le stade LA au stade C ; des fractions croissantes de plasmocytes, de lymphocytes T CD8+, de lymphocytes T CD4+ à mémoire activée, de lymphocytes T auxiliaires folliculaires, de lymphocytes T régulateurs (Tregs) et de lymphocytes T gamma delta peuvent être découverts au stade LA par rapport au stade EA. Les résultats ci-dessus convenaient à tous les sérotypes, suggérant que différents sérotypes n'avaient pas de différences immunitaires évidentes. L'augmentation de la réponse immunitaire a éliminé le DENV qui a évité les symptômes de la dengue [27] et la cinétique de la réponse immunitaire dépendante du nombre initial de lymphocytes correspondait à la gravité de la maladie [53]. Nos études ont montré que les réponses immunitaires neutrophiles et humorales sont activées dans la DHF au stade LA, mais que l'ensemble du système immunitaire a été endommagé dans la DHF par rapport à la DF, ce qui était une raison possible menant à la DHF.

Fait intéressant, l'enrichissement KEGG a montré que les DEG (entre le stade EA et le stade C, et entre le stade EA et le stade LA) étaient enrichis dans les voies de la maladie à coronavirus - COVID-19, grippe A, hépatite C et rougeole, ce qui implique le coronavirus [54] , Alphainfluenzavirus influenzae [55], le virus de l'hépatite C [56] et le morbillivirus de la rougeole ont également régulé positivement ces gènes pendant l'infection et avaient un mécanisme pathogène commun.

Les profils d'expression génique des bases de données publiques (GEO) ont été appliqués pour explorer les biomarqueurs de la dengue par les chercheurs. Plusieurs études ont utilisé plusieurs gènes pour distinguer les patients atteints de dengue des échantillons sains [39, 40], DHF de DF [41] et différents stades [57]. Cependant, les listes multi-gènes peuvent limiter la sensibilité et la spécificité des DEG en tant que biomarqueurs de la maladie [58, 59].

Par rapport aux études précédentes [39,40,41], notre étude présentait plusieurs avantages. Tout d'abord, cette étude était basée sur des analyses de gène unique qui nous ont permis d'identifier un biomarqueur stable et robuste et ces biomarqueurs ont été identifiés et vérifiés sur des ensembles de données indépendants, ce qui a augmenté la précision de notre étude. Deuxièmement, nous avons combiné trois méthodes, y compris DEG, WGCNA et ROC pour dépister, vérifier et tester des biomarqueurs pour les diagnostics de dengue qui augmentent la précision de nos résultats, différant des études précieuses uniquement en fonction de l'analyse DEG. Troisièmement, nous avons analysé 22 types de cellules immunitaires, y compris des cellules immunitaires moins attentives basées sur la séquence d'ARN, ce qui a contribué à mieux comprendre l'ensemble de la réponse immunitaire lors d'une infection par le DENV et à explorer les corrélations entre les gènes et les cellules immunitaires. Une étude précédente a montré que l'altération du sous-ensemble de lymphocytes périphériques peut être un prédicteur indépendant des caractéristiques cliniques et de l'efficacité du traitement du COVID-19 [60]. Fait intéressant, nous avons constaté que la fraction des cellules plasmatiques, des lymphocytes T CD4+ à mémoire activée et des monocytes chez les patients atteints de dengue avait également des caractéristiques cliniques et pouvait distinguer ces stades cliniques chez les patients atteints de dengue. Enfin, pas seulement pour un seul sérotype, notre étude comprenait quatre sérotypes qui ont été impliqués dans des analyses séparées et combinées.

Il y a encore une lacune à cette étude, car l'étude n'utilise que des ensembles de données publics pour analyser, vérifier et tester, sans vérification ni test clinique. Notre recherche a aidé à distinguer le stade et la gravité de l'infection par la dengue et à comprendre le mécanisme pathogène de différents sérotypes, et aidera à analyser les mécanismes de la DHF et à bénéficier d'un traitement clinique à l'avenir.

En conclusion, sur la base des niveaux d'expression de CD38 et des fractions de cellules plasmatiques, de lymphocytes T CD4+ mémoire activés et de monocytes, nous pouvons discriminer admirablement trois stades cliniques pour les patients atteints de dengue (les résultats conviennent à tout sérotype) ; Le ZNF595 permet de mieux distinguer la dengue hémorragique (DHF) de la dengue (DF). Les gènes liés à l'autophagie régulés positivement contribuent à comprendre les mécanismes de la DHF.

Les ensembles de données soutenant les conclusions de cet article sont disponibles dans la base de données Gene Expression Omnibus (GEO) (GSE43777, GSE51808 et GSE28405).

Gènes différentiellement exprimés

Analyse pondérée du réseau de co-expression

Courbe caractéristique de l'opérateur du récepteur

Ontologie des gènes

Encyclopédie de Kyoto des gènes et des génomes

Analyse d'enrichissement d'ensembles de gènes

Aire sous la courbe

Dengue hémorragique

La fièvre de la dengue

Organisation mondiale de la santé OMS

Amélioration dépendante des anticorps

Virus de la dengue

Protéine antivirale des mitochondries

Syndrome de choc de la dengue

Analyse des composants principaux

Stade de convalescence

Stade aigu précoce

Stade aigu tardif

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Cellule mononucléaire du sang périphérique

Matrice de recouvrement topologique

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Nous tenons à remercier M. Yinde Huang pour son soutien dans les analyses bioinformatiques et à rendre hommage aux contributions des bases de données publiques telles que GEO à la médecine humaine.

L'étude a été parrainée par la Fondation de l'initiative CAMS pour la médecine innovante (2021-I2M-1-036) ; la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (31970868); Projet de formation santé Yunnan des talents de haut niveau (L-2019030) ; Projet d'équipe d'innovation du département des sciences et technologies du Yunnan (202105AE160020).

Institut de biologie médicale, Académie chinoise des sciences médicales et Peking Union Medical College, Kunming, 650118, République populaire de Chine

Nan Xiong et Qiangming Sun

Université médicale de Kunming, Kunming, 650500, République populaire de Chine

Nan Xiong

Yunnan Key Laboratory of Vaccine Research and Development on Severe Infectious Diseases, Kunming, 650118, République populaire de Chine

Nan Xiong et Qiangming Sun

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NX : Conceptualisation, Rédaction—ébauche originale, Rédaction—révision et édition, Logiciel, Visualisation. QS : Acquisition de financement, Administration de projet, Supervision, Conceptualisation, Rédaction - révision et édition. Tous les auteurs ont lu et approuvé le manuscrit final

Correspondance avec Qiangming Sun.

N'est pas applicable.

N'est pas applicable.

Les auteurs déclarent n'avoir aucun intérêt concurrent.

Springer Nature reste neutre en ce qui concerne les revendications juridictionnelles dans les cartes publiées et les affiliations institutionnelles.

(A–C) L'ACP montre que différentes étapes peuvent être distinguées. Analyse pondérée du réseau de co-expression (WGCNA). (D–F) Affichage de la hauteur de coupure. (G – I) Regroupement d'échantillons. (J) Gène partagé (CCL2) au stade LA entre les DEG (entre la dengue hémorragique (DHF) et la dengue (DF)) et 232 gènes liés à l'autophagie, et (K) ses niveaux d'expression. Niveaux d'expression similaires de CD38 et CDKN1C entre DH et DHF (L) et parmi différents sérotypes (M). S1, sérotype I ; S2, sérotype II ; S3, sérotype III ; S4, sérotype IV. (C, stade de convalescence ; EA, stade aigu précoce ; LA, stade aigu tardif).

Analyse de la valeur de diagnostic de stadification de CD38 et CDKN1C pour quatre sérotypes parmi trois groupes de comparaison par aire sous la courbe (AUC) dans l'ensemble de formation (ensemble de données GSE43777 de la plateforme GLP201), respectivement. (A) C vs EA dans le sérotype I ; (B) C vs LA dans le sérotype I ; (C) EA vs LA dans le sérotype I ; (D) C vs EA dans le sérotype II ; (E) C vs LA dans le sérotype II ; (F) EA vs LA dans le sérotype II ; (G) C vs EA dans le sérotype III ; (H) C vs LA dans le sérotype III ; (I) EA vs LA dans le sérotype III ; (J) C vs EA dans le sérotype IV ; (K) C vs LA dans le sérotype IV ; (L) EA vs LA dans le sérotype IV. (C, stades de convalescence ; EA, stade aigu précoce ; LA, stade aigu tardif).

Analyse de la valeur de diagnostic de stadification de CD38 et CDKN1C pour quatre sérotypes parmi trois groupes de comparaison par aire sous la courbe (AUC) dans l'ensemble de tests (ensemble de données GSE43777 de la plate-forme GLP570), respectivement. (A) C vs EA dans le sérotype I ; (B) C vs LA dans le sérotype I ; (C) EA vs LA dans le sérotype I ; (D) C vs EA dans le sérotype II ; (E) C vs LA dans le sérotype II ; (F) EA vs LA dans le sérotype II ; (G) C vs EA dans le sérotype III ; (H) C vs LA dans le sérotype III ; (I) EA vs LA dans le sérotype III ; (J) C vs EA dans le sérotype IV ; (K) C vs LA dans le sérotype IV ; (L) EA vs LA dans le sérotype IV. (C, stade de convalescence ; EA, stade aigu précoce ; LA, stade aigu tardif).

Les diagrammes de violon et les cartes thermiques affichent les différences immunitaires des cellules immunitaires dans différents groupes de comparaison. (A) Stades C vs EA dans le sérotype I. (B) Stades C vs LA dans le sérotype I. (C) Stades EA vs LA dans le sérotype I. (D) Carte thermique des différences immunitaires du sérotype I en trois étapes. (E) Stades C vs EA dans le sérotype II. (F) Stades C vs LA dans le sérotype II. (G) Stades EA vs LA dans le sérotype II. (H) Carte thermique de différence immunitaire du sérotype II en trois étapes. (I) Stades C vs EA dans le sérotype III. (J) Stades C vs LA dans le sérotype III. (K) Stades EA vs LA dans le sérotype III. (L) Carte thermique de différence immunitaire du sérotype III en trois étapes. (M) Stades C vs EA dans le sérotype IV. (N) Stades C vs LA dans le sérotype IV. (O) Stades EA vs LA dans le sérotype IV. (P) Carte thermique de différence immunitaire du sérotype IV en trois étapes. (C, stade de convalescence ; EA, stade aigu précoce ; LA, stade aigu tardif).

Corrélation entre CD38 et 22 types de cellules immunitaires (rectangle rouge : statistiquement significatif (P < 0,05)). (A) Dans le sérotype I ; (B) dans le sérotype II ; (C) dans le sérotype III ; (D) dans le sérotype IV. (C, stade de convalescence ; EA, stade aigu précoce ; LA, stade aigu tardif).

Analyse de la valeur diagnostique de la stadification des cellules immunitaires pour la dengue par zone sous la courbe (AUC) dans chaque sérotype. (A) Stades C vs EA dans le sérotype I. (B) Stades C vs LA dans le sérotype I. (C) Stades EA vs LA dans le sérotype I. (D) Stades C vs EA dans le sérotype II. (E) Stades C vs LA dans le sérotype II. (F) Stades EA vs LA dans le sérotype II. (G) Stades C vs EA dans le sérotype III. (H) Stades C vs LA dans le sérotype III. (I) Stades EA vs LA dans le sérotype III. (J) Stades C vs EA dans le sérotype IV. (K) Stades C vs LA dans le sérotype IV. (L) Stades EA vs LA dans le sérotype IV. (C, stade de convalescence ; EA, stade aigu précoce ; LA, stade aigu tardif).

Gènes différentiellement exprimés (DEG) dans le groupe C vs EA. (C, stade de convalescence ; EA, stade aigu précoce).

Gènes différentiellement exprimés (DEG) dans le groupe C vs LA. (C, stade de convalescence ; LA, stade aigu tardif).

Gènes différentiellement exprimés (DEG) dans le groupe EA vs LA. (EA, stade aigu précoce ; LA, stade aigu tardif).

. Gènes différentiellement exprimés (DEG) provenant de la comparaison de la dengue hémorragique (DHF) avec la dengue (DF) dans le groupe EA. (EA, stade aigu précoce).

. Gènes différentiellement exprimés (DEG) provenant de la comparaison de la dengue hémorragique (DHF) avec la dengue (DF) dans le groupe LA. (LA, phase aiguë tardive).

. Pli de gènes exprimé de manière différentielle dans un sérotype individuel pour trois groupes de comparaison. (C, stade de convalescence ; EA, stade aigu précoce ; LA, stade aigu tardif).

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Réimpressions et autorisations

Xiong, N., Sun, Q. Identification de biomarqueurs liés au stade et à la gravité et exploration du paysage immunitaire de la dengue par des analyses complètes. Virol J 19, 130 (2022). https://doi.org/10.1186/s12985-022-01853-8

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Reçu : 23 janvier 2022

Accepté : 14 juillet 2022

Publié: 02 août 2022

DOI : https://doi.org/10.1186/s12985-022-01853-8

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