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Rapports scientifiques volume 12, Numéro d'article : 19866 (2022) Citer cet article

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La troponine I cardiaque (cTnI) est un biomarqueur cardiaque spécifique pour le diagnostic de l'infarctus aigu du myocarde (IAM). Un test sensible et simple au point de service (POCT) est toujours nécessaire pour la détection précoce de l'IAM. Pour répondre à ce besoin, nous avons développé un test de bandelette dip basé sur un immunodosage en sandwich couplé à un système d'amélioration de l'argent. La pré-incubation et l'amélioration de l'argent ont été introduites dans la bandelette pour augmenter la sensibilité. En raison de la réaction catalytique de la solution d'amélioration de l'argent, la couleur rouge des AuNPs a changé en brun foncé lorsque les ions d'argent ont précipité et agrandi les AuNPs. Les résultats obtenus étaient facilement visibles à l'œil nu. Pour l'analyse quantitative, l'intensité de la couleur des résultats a été analysée à l'aide d'un smartphone avec une application de sélection de couleurs RVB. Les effets des paramètres de fonctionnement (volume de conjugué AuNP-Ab, volume d'échantillon, temps d'incubation et temps d'analyse) ont été étudiés et optimisés. Dans des conditions optimales, la limite de détection (LOD) à l'œil nu était de 0,5 ng/mL. Le LOD avec l'amélioration de l'argent était 50 fois plus faible que sans. Pour l'analyse quantitative à l'aide du smartphone, la linéarité de la détection a été observée dans la plage de 0,5 à 50 ng/mL (R2 = 0,9952) et la LOD était de 0,12 ng/mL. La méthode développée a été appliquée avec succès à la détection de cTnI dans des échantillons de sérum, obtenant des récupérations analytiques et un % RSD dans les plages de 96,10 à 119,17 % et de 2,91 à 5,13 %, respectivement. De plus, ce test développé n'a pas eu de réaction croisée avec les protéines sériques potentiellement interférentes. Ces résultats ont montré le grand potentiel de ce test de bandelettes dip en tant que POCT alternatif pour la détection de la cTnI sérique.

Les maladies cardiovasculaires (MCV) sont un groupe de troubles cardiaques et vasculaires. Le nombre et la mortalité des patients atteints de maladies cardiovasculaires ont augmenté chaque année et cette tendance devrait se poursuivre à l'avenir1,2. Un blocage des artères coronaires entraîne une réduction du flux sanguin et un apport sanguin insuffisant au muscle cardiaque, entraînant ses dommages. Le muscle cardiaque endommagé se détériorera et finira par se nécroser et mourir. Ce type de lésion cardiaque est connu sous le nom d'infarctus du myocarde (IM). Lorsque le cœur est endommagé, des biomarqueurs cardiaques tels que la myoglobine, la créatine kinase-bande myocardique (CK-MB), la troponine cardiaque T (cTnT) et la troponine cardiaque I (cTnI), sont libérés dans la circulation sanguine3. Actuellement, la cTnI est considérée comme le biomarqueur cardiaque le plus spécifique et l'étalon-or pour le diagnostic de l'infarctus du myocarde en raison de son isoforme cardiaque unique4,5. cTnI est une protéine située entre les filaments d'actine du tissu musculaire cardiaque normal. Après le début de la douleur thoracique, les fragments de troponine cardiaque sont élevés dans la circulation sanguine en 4 à 9 h, la forme prédominante étant le complexe cTnC-cTnI6. Sa concentration continue d'augmenter jusqu'à atteindre un pic 12 à 24 h plus tard et à rester élevée jusqu'à 10 à 14 jours. L'ampleur de l'élévation de la troponine cardiaque est associée à la gravité ou à la taille de la lésion cardiaque7,8. Par conséquent, la mesure du niveau de cTnI fait partie d'une évaluation du risque clinique qui permet un diagnostic, un pronostic et une surveillance précoces de l'infarctus aigu du myocarde (IAM) avec un niveau de cTnI de 0,4 ng/mL ou plus considéré comme indicatif d'un IAM9,10,11.

De nos jours, la méthode conventionnelle de mesure des biomarqueurs cardiaques est l'immunodosage par électrochimiluminescence (ECLIA)12,13,14. Bien que la méthode offre une sensibilité et une spécificité élevées, elle nécessite un grand système de détection de paillasse et des opérateurs qualifiés. De plus, les instruments sont très coûteux et ont des coûts d'exploitation élevés. Alternativement, les appareils POCT sont des outils portables qui aident le personnel médical à fournir des soins immédiats aux patients. Les immunoessais à flux latéral (LFIA) sont des outils de dépistage potentiels utilisés comme POCT. En effet, ils sont rentables et sont des tests simples qui peuvent être utilisés avec une formation minimale. Au cours des dernières années, des LFIA ont été rapportés pour la mesure de la troponine I cardiaque à l'aide de divers marqueurs de signal tels que les nanoparticules d'or doubles15, les microsphères fluorescentes16, les points quantiques17, les particules magnétiques18,19,20, le marquage catalysé par des enzymes21,22, les nanoparticules à conversion ascendante23,24 et nanoparticules dopées aux ions25. Cependant, ces tests ont leurs propres limites. Par exemple, les particules fluorescentes nécessitent un lecteur de fluorescence, et il faut se préoccuper de la photostabilité et du rendement quantique. Pour le marquage catalysé par une enzyme, les rapports décrivent les interactions entre l'enzyme et le substrat, et leur analyse à l'aide de détecteurs chimiluminométriques. Ces techniques sont compliquées par les lecteurs de capteurs associés, qui nécessitent des dépenses de fonctionnement et de matériel importantes. De plus, les procédés de marquage du signal de l'anticorps sont fastidieux.

Les nanoparticules d'or colloïdal (AuNP) ont été largement utilisées comme marqueurs avec des anticorps pour les immunodosages colorimétriques en raison de leur biocompatibilité, de leur simplicité de synthèse, de leur stabilité, de leur précision et de leurs propriétés optiques hautes performances26. Cependant, ils sont normalement limités par une faible sensibilité de détection. Plusieurs groupes ont utilisé l'amplification du signal, y compris l'amélioration de l'argent, pour améliorer la sensibilité de ces immunodosages basés sur AuNP27,28,29. Cette méthode utilise la réduction catalytique des ions argent et les AuNP agissent comme des noyaux, conduisant à la précipitation des ions argent sur les surfaces AuNP. La grande taille des particules des AuNPs fournit la couleur sombre et augmente même leur intensité. Cela les rend plus visibles, permettant aux résultats d'être lus à l'œil nu. Une puce en poly(diméthylsiloxane) (PDMS) avec enrichissement en argent a été proposée pour la détection colorimétrique de cTnI28. Cependant, la fabrication d'une telle puce est une procédure compliquée et le PDMS est facilement déformable, conduisant parfois à un placement de motif imprécis. De plus, la coloration immunogold à l'argent pour améliorer la sensibilité pour la détection de cTnI utilise des plaques à 96 puits, un processus qui nécessite du personnel qualifié et prend du temps29. Dans ce travail, la méthode d'amélioration de l'argent a été introduite pour augmenter la sensibilité dans le test de la bandelette.

Récemment, les dispositifs POCT ont été intégrés à un dosage colorimétrique pour une détection simple et rapide30,31. Leurs résultats peuvent être facilement interprétés à l'aide d'un appareil photo numérique avec une fonction de traitement d'image pour quantifier l'intensité de la couleur des résultats liés à la concentration de l'analyte. De nos jours, les smartphones équipés d'appareils photo numériques ont commencé à être utilisés comme outils d'analyse de données. Avec un logiciel approprié, ils ont été utilisés pour la détection et la quantification pour des mesures colorimétriques. Certains smartphones sont établis comme détecteurs analytiques portables en raison de leur simplicité, de leur portabilité et de leur faible coût par rapport aux instruments commerciaux32. Par conséquent, l'utilisation d'un smartphone est un choix alternatif pour la mesure quantitative.

Dans cette étude, une bandelette dip à base d'AuNP utilisant un immunodosage sandwich couplé à une amélioration de l'argent a été développée pour être utilisée comme dispositif POCT, fournissant un test simple et sensible qui élimine le besoin d'équipements compliqués et coûteux. Par ce test, les résultats positifs étaient de couleur brun foncé et pouvaient être facilement observés à l'œil nu. La sensibilité de détection a été améliorée de 50 fois par rapport au test sans amélioration à l'argent. De plus, une colorimétrie basée sur un smartphone a été intégrée au système pour une mesure quantitative simple du cTnI. Le dispositif développé a été appliqué avec succès pour la détermination de cTnI dans des échantillons de sérum avec une bonne précision et fiabilité.

Pour conjuguer les AuNPs avec l'anticorps, les effets de la concentration de l'anticorps anti-troponine cardiaque I (anti-cTnI) et du pH de la solution AuNPs ont été étudiés. La concentration optimale d'anticorps anti-cTnI pour la conjugaison avec les AuNPs a été déterminée sur la base des résultats avec une série de concentrations (0, 10, 50, 75, 100, 150, 175 et 200 µg/mL). Ensuite, 10% de NaCl a été ajouté au mélange contenant l'anticorps anti-cTnI et les AuNPs. Les résultats sont présentés sur la figure 1a. Lors de l'ajout de NaCl, l'agrégation AuNP a été induite, ce qui a entraîné un changement de couleur des AuNP du rouge au bleu. À de faibles concentrations d'anticorps anti-cTnI, la couleur des AuNP était violette ou rouge-violette en raison d'un excès d'AuNPs libres. Considérant qu'il n'y avait pas de changement de couleur des suspensions AuNP aux concentrations élevées d'anticorps anti-cTnI en raison d'une liaison d'anticorps suffisante. Les spectres UV-visible des AuNP (Fig. 1b) ont montré que l'absorbance (λmax = 520 nm) augmentait avec l'augmentation de la concentration d'anticorps anti-cTnI et atteignait un plateau à 175 µg/mL. Par conséquent, 175 µg/mL d'anticorps anti-cTnI ont été sélectionnés comme concentration à utiliser dans l'expérience suivante.

( a ) Les résultats des solutions AuNP avec différentes concentrations d'anticorps anti-cTnI après l'ajout de 10% de NaCl. (b) Tracé de l'absorbance observée à 520 nm en fonction de la concentration d'anticorps anti-cTnI. ( c ) Tracé des rapports d'absorbance des AuNP à travers le pH après l'ajout de 10 % de NaCl avec une concentration d'anticorps anti-cTnI fixe de 175 µg/mL.

Étant donné que le pH affecte l'activité et la stabilité de liaison AuNP-Ab, il a été étudié en ajustant les valeurs de pH de 5 à 9. La stabilité et la polydispersité de la solution colloïdale ont été déterminées en calculant le rapport d'absorbance à λmax/580 nm et 600 nm/λmax (λmax = 520 nm), respectivement27. Les résultats (Fig. 1c) ont montré que la plus grande stabilité et la moindre polydispersion se produisaient à pH 7. Par conséquent, ce pH optimal a été choisi pour la préparation ultérieure d'AuNP conjugués à l'anticorps anti-cTnI.

Pour caractériser les AuNPs conjugués à l'anticorps anti-cTnI, des spectres UV-visible et des images TEM ont été utilisés pour comparer les AuNPs nus et conjugués à l'Ab. Comme le montre la figure 2a, les AuNP non conjugués possédaient un spectre d'extinction des plasmons de surface avec un pic maximal à 520 nm. Après conjugaison des AuNPs avec un anticorps anti-cTnI, les spectres UV-vis ont montré un spectre d'absorption légèrement augmenté avec le pic légèrement décalé (à 530 nm). Ce décalage spectral a été causé par un changement de la résonance plasmonique de surface localisée affectée par la couche d'adhérence des protéines. De plus, les images TEM (Fig. 2b) ont montré que le diamètre moyen des AuNP était de 20 nm. Après absorption physique de l'anticorps sur les AuNP, le diamètre moyen est passé à 25 nm. Ces résultats ont indiqué une conjugaison réussie de l'anticorps anti-cTnI sur les AuNPs33,34.

( a ) Spectres d'extinction des plasmons de surface (par spectres UV-visible) des AuNPs nus et conjugués à l'Ab. ( b ) Images au microscope électronique à transmission de ( i ) AuNPs et (ii) Ab-conjugués AuNPs.

Pour obtenir la détection hautement sensible de cTnI nécessaire au diagnostic de l'IAM, une bandelette réactive basée sur un immunodosage en sandwich avec des étapes de pré-incubation et d'amélioration du signal a été développée, couplée à une application de détection colorimétrique basée sur un smartphone (Fig. 3b). La pré-incubation du conjugué AuNP-Ab avec l'échantillon a été introduite dans ce test développé pour compléter la liaison du conjugué AuNP-Ab avec cTnI. Il a été démontré que cette procédure augmente la sensibilité, la reproductibilité et la précision du test35. Après avoir placé la bandelette plongeante dans le mélange de conjugué AuNP-Ab et d'échantillon contenant cTnI, le conjugué cTnI-AuNP-Ab a migré à travers une membrane de nitrocellulose par capillarité.

( a ) Illustration schématique de la bandelette d'immersion basée sur un immunoessai en sandwich. (b) Schéma de principe de la procédure de la bandelette d'immersion. ( c ) Schéma de la réaction d'amélioration de l'argent montrant le changement de couleur AuNP.

En présence de cTnI, l'anticorps anti-cTnI immobilisé s'est lié spécifiquement au conjugué cTnI-AuNP-Ab au niveau de la ligne de test. Pendant ce temps, le conjugué AuNP-Ab libre en excès s'écoulait vers la ligne de contrôle et réagissait avec l'anticorps anti-souris de chèvre. Les résultats ont été vus comme une couleur rouge à la fois sur les lignes de test et de contrôle. Par contre, en l'absence de cTnI, les résultats n'ont montré la couleur rouge qu'au niveau de la ligne de contrôle. Cependant, la détection avec cette méthode avait une faible sensibilité.

Pour augmenter la sensibilité, une amélioration à l'argent a été appliquée à la bandelette d'immersion sur la base d'une réaction chromogénique catalysée par les AuNP (Fig. 3c). Après l'application du mélange de solution de nitrate d'argent et d'hydroquinone sur la bandelette, les ions d'argent ont été réduits par l'hydroquinone pour former une coquille sur les AuNP. La couleur rouge des AuNPs a changé en une couleur brun foncé, apparemment en raison des ions d'argent précipités sur les surfaces des AuNPs. Les résultats positifs (en présence de cTnI) présentaient une couleur brun foncé à la fois sur les lignes de test et de contrôle, tandis que les résultats négatifs (en l'absence de cTnI) indiquaient la couleur brun foncé uniquement sur la ligne de contrôle. Les résultats des tests étaient détectables et pouvaient être interprétés semi-quantitativement à l'œil nu. De plus, les résultats pourraient être quantifiés en utilisant l'intensité RVB par smartphone avec une application RVB.

Les paramètres susceptibles d'influencer la sensibilité de la bandelette ont été investigués. Ceux-ci comprenaient le volume d'AuNPs conjugués à l'anticorps anti-cTnI, le volume de l'échantillon, le temps d'incubation et le temps d'analyse. Pour obtenir des résultats, l'intensité RVB sur la ligne de test après un test avec 250 ng/mL de cTnI suivi d'une amélioration du signal a été interprétée par smartphone avec une application de sélection de couleurs RVB.

L'effet du volume de conjugué AuNP-Ab a été optimisé en ajoutant le conjugué AuNP-Ab dans des volumes de 3, 5, 7 ou 9 µL à des échantillons contenant cTnI à 40 µL avec incubation ultérieure pendant 60 min. L'intensité RVB la plus élevée (rapport B/T) a été obtenue lorsque le volume du conjugué AuNP-Ab était de 7 µL (Fig. 4a). Par conséquent, cette concentration de conjugué AuNP-Ab a été utilisée pour d'autres expériences.

Optimisation de divers paramètres qui affectent l'immunodosage à bandelette : (a) volume de conjugué AuNP-Ab, (b) volume d'échantillon, (c) temps d'incubation et (d) temps d'analyse. Les points de données représentent la moyenne de trois répétitions (n = 3), barre d'erreur.

Les volumes d'échantillons (40, 60 et 80 µL) ont été comparés. Comme le montre la figure 4b, l'intensité de la couleur a augmenté avec l'augmentation du volume de l'échantillon de 40 à 60 µL. L'intensité RVB la plus élevée (rapport B/T) au niveau de la ligne de test a été affichée à 60 µL. Ensuite, l'intensité de la couleur a diminué à 80 µL. L'« effet crochet » s'est produit lorsque le volume de l'échantillon était supérieur à 60 µL en raison d'une concentration élevée d'analyte. Sur la base de ces résultats, 60 µL ont été sélectionnés comme volume d'échantillon optimal pour la bandelette réactive.

L'effet du temps d'incubation sur la liaison antigène-anticorps a été examiné à température ambiante pendant 0, 15, 30, 45 et 60 min. Comme le montre la figure 4c, le B/T de l'intensité RVB au niveau de la ligne de test a augmenté à mesure que le temps d'incubation augmentait et atteignait un état de plateau à 45 min. Cela indiquait que la réaction entre le conjugué AuNP-Ab et cTnI était complète. Nous avons donc choisi 45 min comme temps d'incubation optimal pour le test développé, un temps plus court que celui requis par le kit ELISA commercial.

L'une des caractéristiques les plus importantes d'un test de diagnostic est le temps d'analyse. Dans cet essai, l'activateur d'argent a fait passer la couleur de la ligne de test du rouge au brun foncé. Le temps d'analyse pour l'interprétation des résultats a été étudié sur 30 min (à 0, 5, 10, 15, 20, 25 et 30 min). L'intensité de la couleur a augmenté avec l'augmentation du temps d'analyse de 0 à 15 min (Fig. 4d). L'intensité B/T la plus élevée de RVB sur la ligne de test a été atteinte à 15 min et n'a pas augmenté davantage. Les résultats des tests sur la bandelette étaient stables à 15–30 min. Par conséquent, 15 minutes ont été choisies comme temps d'analyse optimal pour la procédure de bandelette réactive.

Les performances de la bande d'immersion développée ont été analysées dans les conditions optimales décrites ci-dessus. Des échantillons de sérum contenant cTnI ont été analysés par électrochimiluminescence pour déterminer la concentration de cTnI. Les résultats ont été obtenus en utilisant des sérums enrichis en cTnI à des concentrations allant de 0 à 250 ng/mL (Fig. 5a). L'intensité de la couleur sur la ligne de test a été contrôlée avant et après l'amélioration du signal. La limite de détection (LOD) atteinte à l'œil nu sans et avec rehaussement à l'argent était de 25 et 0,5 ng/mL, respectivement. Ainsi, l'amélioration à l'argent a produit une augmentation de 50 fois de la sensibilité de cette bandelette de test cTnI développée.

( a ) Images de cTnI détectées à des concentrations de 0 à 250 ng / ml (i) avant et (ii) après l'amélioration de l'argent. ( b ) Tracé de l'intensité RVB (rapport B / T) par rapport à la concentration de cTnI interprétée par un smartphone avec une application de sélection de couleurs RVB. ( c ) Courbe d'étalonnage de la concentration de cTnI dans la plage de 0 à 50 ng / ml. ( d ) Courbe d'étalonnage de la concentration de cTnI dans la plage de 50 à 250 ng / ml.

Pour la mesure quantitative à l'aide d'un smartphone, le résultat d'intérêt était l'intensité RVB (rapport B/T) sur la ligne de test, obtenue à l'aide d'une application de sélection de couleurs RVB. L'intensité RVB en fonction de la concentration de cTnI a été tracée (Fig. 5b). On a constaté que les rapports B/T de l'intensité RVB augmentaient proportionnellement à la concentration de cTnI. Cependant, lorsque la concentration de cTnI atteint 100 ng/mL, l'augmentation de l'intensité ralentit et semble se stabiliser à 250 ng/mL. Comme le montre la figure 5c, il existait une bonne relation linéaire entre l'intensité du signal et la concentration de cTnI dans la plage de 0, 5 à 50 ng / ml. L'équation linéaire et son coefficient de corrélation correspondant étaient respectivement Y (linéaire) = 0,0113x + 1,0286 et R2 = 0,9952, où Y est l'intensité RVB (rapport B/T) à la ligne de test et X est la concentration de cTnI. Les barres d'erreur du RSD sont dérivées de trois mesures indépendantes. La LD calculée (3,3 ET/pente) s'est avérée être de 0,12 ng/mL, une valeur inférieure au seuil de cTnI (0,4 ng/mL) utilisé pour le diagnostic de l'infarctus aigu du myocarde (IAM)9,10,11. De plus, des concentrations de cTnI plus élevées (50 à 250 ng / ml) pourraient être obtenues à partir du tracé d'étalonnage en fonction de la ligne de tendance logarithmique (Fig. 5d). L'équation logarithmique et son coefficient de corrélation correspondant étaient respectivement Y(Logarithmique) = 1,4804ln(X) − 4,1308 et R2 = 0,9827. Étant donné qu'avec l'apparition de douleurs thoraciques, le niveau de cTnI sérique augmente dans les 4 h, culmine en 12 à 24 h et reste élevé jusqu'à 10 à 14 jours36, notre test de bandelettes dip développé pourrait potentiellement être utilisé pour le diagnostic de l'IAM.

La réactivité croisée possible du test développé a été étudiée pour évaluer sa spécificité en présence de substances potentiellement interférentes trouvées dans le sérum. Des tests ont été effectués avec de l'albumine, de la bilirubine et du cholestérol à des niveaux dans leurs plages normales pour le sérum humain (4000 mg/dL d'albumine, 1 mg/dL de bilirubine et 200 mg/dL de cholestérol). Comme le montre la figure 6, les résultats du test ont démontré que la couleur brun foncé apparaissait sur la ligne de test en présence de 100 ng/mL de cTnI, mais pas avec aucune des autres substances testées. De plus, il n'y a pas de différences significatives dans l'intensité de la couleur de la ligne de test des échantillons contenant des interférences par rapport au blanc de sérum. Ces résultats ont indiqué que l'immunodosage à bandelettes développé a conservé sa spécificité vis-à-vis de la détermination de cTnI malgré la présence d'albumine, de bilirubine et de cholestérol. Pour les substances interférentes, l'hémoglobine peut provoquer des interférences si le sérum hémolysé a été présenté37,38. Les résultats de la concentration en troponine I cardiaque doivent donc être interprétés avec prudence pour le sérum légèrement hémolysé avec la couleur rose légèrement détectable, tandis que le sérum modérément ou sévèrement hémolysé doit être rejeté.

Graphique à barres et images du test de réactivité croisée après amélioration à l'argent, évaluant l'intensité de la couleur du rapport B/T du blanc sérique, de la cTnI, de l'albumine, de la bilirubine et du cholestérol.

Afin de valider l'exactitude et la précision de l'immunodosage à bandelettes développé pour la détermination de cTnI, la bandelette de test développée a été utilisée pour déterminer cTnI dans un échantillon de sérum. Les sérums ont été dopés avec la protéine cTnI à des concentrations désignées de 3, 11, 27 et 80 ng/mL. Les résultats sont présentés dans le tableau 1. Les récupérations analytiques et le % RSD ont été obtenus dans les plages de 96,10 à 119,17 % et de 2,91 à 5,13 %, respectivement. Ce test immunologique à bandelettes développé a ainsi fourni une détection exacte et précise de cTnI dans des échantillons de sérum.

Un test immunologique simple et sensible à base de bandelettes dip, couplé à de l'or colloïdal enrichi en argent, a été développé pour la détection et la quantification de cTnI. Un système d'amélioration de l'argent a été utilisé pour l'amplification du signal dans les AuNP de la bandelette développée. Les résultats ont été facilement observés à l'œil nu (LOD 0,5 ng/mL). De plus, un smartphone avec application de sélection de couleurs RVB a été évalué en raison de sa simplicité, de son faible coût et de son approche innovante pour la quantification des résultats. En utilisant des interprétations basées sur l'intensité RVB, la LOD s'est avérée être de 0,12 ng/mL avec une bonne corrélation linéaire (R2 = 0,9952) dans la plage de 0,5 à 50 ng/mL. Le test développé a montré un potentiel encourageant pour la détection de cTnI dans le sérum humain. Il a montré une spécificité exceptionnelle pour la détection de cTnI sans réactivité croisée avec des protéines plasmatiques importantes. Par conséquent, cette approche d'un test alternatif pour l'analyse de la cTnI chez les patients suspectés d'IAM est très prometteuse.

L'immunoglobuline G anti-souris de chèvre a été obtenue auprès de Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. (West Grove, PA, USA). L'anticorps monoclonal de la troponine cardiaque I (4T21cc-19C7cc) et l'anticorps monoclonal de la troponine cardiaque I (4T21cc-560) ont été achetés auprès de HyTest Ltd. (Turku, Finlande). Le complexe IC de troponine cardiaque a été obtenu auprès de MyBioSource, Inc. (San Diego, Californie, États-Unis). L'albumine, la bilirubine, le cholestérol, le chlorure d'or (III) trihydraté (HAuCl4•3H2O), le sérum humain, la solution saline tamponnée au phosphate (PBS), le nitrate d'argent et le Tween 20 ont été achetés chez Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). L'albumine de sérum bovin (BSA) a été achetée auprès de Capricorn Scientific GmbH (Ebsdorfergrund, Allemagne). L'hydroquinone a été achetée auprès de Tokyo Chemical Industry Co., Ltd. (Tokyo, Japon). L'acide citrique monohydraté et le citrate de sodium dihydraté ont été obtenus auprès de Bio Basic Inc. (Ontario, Canada). Tous les produits chimiques et réactifs de qualité analytique et l'eau de broyage Q (18 MΩ-cm) ont été utilisés dans les expériences.

Les AuNPs (20 nm) ont été synthétisés en utilisant une légère modification d'une procédure précédemment rapportée39. En bref, 100 ml de HAuCl4 à 0,01 % dissous dans de l'eau milli-Q ont été bouillis sous agitation continue. Deux ml de citrate trisodique à 1 % ont été ajoutés et agités pendant 5 min (jusqu'à ce que la couleur rouge apparaisse), puis la solution a été refroidie à température ambiante sous agitation continue. Enfin, 20 nm d'AuNPs ont été obtenus. La solution AuNP a été stockée à 4 ° C dans une bouteille recouverte d'une feuille d'aluminium pour une utilisation ultérieure. Les AuNPs synthétisés ont été caractérisés par spectrométrie UV-visible à l'aide d'un spectrophotomètre NanoDrop 2000 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) et par microscopie électronique à transmission (TEM) à l'aide d'un microscope électronique JEM-2100 (JEOL Ltd., Tokyo, Japon) comme illustré à la figure 2b (i).

Les AuNPs conjugués à l'anticorps anti-cTnI ont été préparés en mélangeant 100 µL d'anticorps anti-cTnI à 175 µg/mL et 1 mL d'AuNPs de 20 nm à pH 7, suivi d'une incubation pendant 1 h à température ambiante avec agitation continue. Par la suite, 100 µL de BSA à 5 % dans du PBS 10 mM pH 7,4 ont été ajoutés à la solution pour réduire la liaison non spécifique des AuNPs avec d'autres molécules. Après incubation pendant 1 h à température ambiante, le mélange a été centrifugé à 12 000 tr/min pendant 45 min à 4 °C, avec élimination ultérieure du surnageant. Le culot a ensuite été remis en suspension dans 5 % de BSA dans du PBS 10 mM pH 7,4 jusqu'à un volume final de 100 µL. Cette solution AuNP conjuguée à un anticorps anti-cTnI prête à l'emploi a été stockée à 4 ° C. Les AuNPs conjugués à des anticorps anti-cTnI ont été caractérisés par le spectrophotomètre NanoDrop 2000 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, États-Unis) et le microscope électronique JEM-2100 (JEOL Ltd., Tokyo, Japon), comme illustré à la Fig. 2b (ii).

Pour augmenter la sensibilité de détection, une méthode d'amélioration de l'argent a été utilisée dans cette étude. La solution d'amélioration de l'argent a été fraîchement préparée en mélangeant 2 mg/mL de nitrate d'argent avec 5 mg/mL d'hydroquinone dans un tampon citrate pH 3,8 dans un rapport de réactif de 1:1 (V:V).

La bandelette de test développée était composée de 3 parties, y compris un tampon d'échantillon (Whatman FUSION 5), un tampon de nitrocellulose (Whatman AE99) et un tampon absorbant (Whatman CF7) qui ont été collés séquentiellement sur une carte de support en plastique (GE Healthcare, Pittsburgh, PA , États-Unis) comme le montre la figure 3a. Afin de préparer la bandelette de test pour la détection de cTnI, 1 µL d'immunoglobuline G anti-souris de chèvre à 0,5 mg/mL et 1 µL de 1 mg/mL d'anticorps anti-cTnI ont été immobilisés sur le tampon de nitrocellulose au niveau des lignes de contrôle et de test, respectivement . Enfin, la bandelette de test préparée a été séchée pendant 2 h. (La bandelette fabriquée avait une largeur de 4 mm.) La bandelette de test prête à l'emploi a été scellée et stockée à 4 °C. De plus, la bandelette de test était stable pendant une période de stockage d'au moins 3 mois.

La procédure de test d'une bandelette réactive (basée sur un immunodosage en sandwich) pour la détermination de cTnI est illustrée à la Fig. 3b. Soixante µL d'échantillon de sérum ou d'étalon cTnI ont été mélangés avec 7 µL d'AuNP conjugués à un anticorps (conjugué AuNP-Ab) et incubés pendant 45 min dans le puits d'échantillon. Ensuite, la bandelette de test a été plongée dans le puits. Au bout de 5 min, 80 µL d'un tampon courant (0,1 % de Tween 20 dans du PBS 10 mM pH 7,4) ont été ajoutés pour réduire le bruit de fond. Par la suite, 80 µL de la solution d'amélioration à l'argent ont été ajoutés pour terminer la procédure. Le résultat du test a été interprété après 15 min par détection à l'œil nu et par smartphone. Un résultat négatif a été indiqué par la présence d'une seule ligne de contrôle rouge ou brun foncé si avant et après l'amélioration, respectivement. Dans le cas d'un résultat positif, des lignes de test et de contrôle apparaissaient, respectivement rouge/rose et brun foncé, avant et après rehaussement. L'intensité de la couleur au niveau de la ligne de test variait directement avec la concentration de cTnI. La concentration de l'échantillon a pu être estimée à l'œil nu par rapport à l'étalon cTnI. Pour l'analyse quantitative, une image des lignes de test a été prise avec un smartphone (Samsung S10) avec mode automatique et sans flash sous une boîte à lumière de contrôle. Les valeurs moyennes d'intensité rouge-vert-bleu (RVB) ont été analysées à l'aide d'un smartphone avec une application de sélection de couleur RVB. Ensuite, le rapport intensité du bruit de fond par test (B/T) a été calculé à l'aide de l'équation : I (intensité) = (R + G + B)/3. La valeur obtenue a été utilisée pour obtenir la concentration de cTnI avec une courbe d'étalonnage.

Les ensembles de données utilisés et/ou analysés au cours de l'étude en cours sont disponibles auprès de l'auteur correspondant sur demande raisonnable.

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Cette recherche a été soutenue financièrement par le Royal Golden Jubilee (RGJ) Ph.D. Programme (Grant No. PHD/0062/2561), par l'intermédiaire du Thailand Research Fund (TRF) et du National Research Council of Thailand (NRCT). AA et OC apprécient avec gratitude le soutien du projet de recherche par le National Research Council of Thailand (NRCT): N41A640073.

Département de chimie clinique, Faculté de technologie médicale, Université Mahidol, 999 Phutthamonthon 4 Road, Salaya, Nakhon Pathom, 73170, Thaïlande

Napakporn Poosinuntakul, Theerawut Chanmee, Sureerut Porntadavity & Amara Apilux

Centre d'excellence en électrochimie et spectroscopie optique, Département de chimie, Faculté des sciences, Université Chulalongkorn, Bangkok, 10330, Thaïlande

Orawon Chailapakul

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NP et AA ont conceptualisé cette recherche; NP et AA ont conçu les expériences ; NP a réalisé les expériences ; NP et AA formel ont analysé et interprété les données ; Méthodologie de recherche préparée par NP et AA ; NP a rédigé et écrit le manuscrit et préparé toutes les figures et tous les tableaux ; NP, TC et AA ont étudié le manuscrit ; SP, OC et AA ont supervisé cette recherche; TC, SP et AA ont validé le manuscrit ; TC, SP, OC et AA ont révisé et édité le manuscrit. Tous les auteurs ont lu et accepté la version soumise du manuscrit.

Correspondance à Amara Apilux.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

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Réimpressions et autorisations

Poosinuntakul, N., Chanmee, T., Porntadavity, S. et al. Immunoessai à bandelettes d'or colloïdal enrichi en argent intégré à la colorimétrie basée sur smartphone pour la détection sensible du marqueur cardiaque troponine I. Sci Rep 12, 19866 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-24458-1

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Reçu : 31 août 2022

Accepté : 15 novembre 2022

Publié: 18 novembre 2022

DOI : https://doi.org/10.1038/s41598-022-24458-1

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