Visualisation de l'activité du système nerveux entérique à travers le colorant

Communications Biology volume 6, Article number: 236 (2023) Citer cet article

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Des avancées majeures ont été réalisées dans les technologies d'imagerie, mais la plupart des approches méthodologiques actuellement utilisées pour étudier les fonctions neuronales entériques reposent sur des colorants de contraste exogènes qui peuvent interférer avec les fonctions cellulaires ou la survie. Dans le présent article, nous avons étudié si la tomographie par cohérence optique plein champ (FFOCT) pouvait être utilisée pour visualiser et analyser les cellules du système nerveux entérique. Des travaux expérimentaux sur des préparations entières de côlons de souris non fixés ont montré que la FFOCT permet la visualisation du réseau du plexus myentérique tandis que la FFOCT dynamique permet de visualiser et d'identifier in situ des cellules individuelles dans les ganglions myentériques. Les analyses ont également montré que le signal FFOCT dynamique pouvait être modifié par des stimuli externes tels que la vératridine ou des changements d'osmolarité. Ces données suggèrent que la FFOCT dynamique pourrait être d'un grand intérêt pour détecter les changements dans les fonctions des neurones entériques et de la glie dans des conditions normales et pathologiques.

Le système nerveux entérique (ENS) est un réseau neuronal intégré présent dans le tractus gastro-intestinal (GI). Composé de neurones et de cellules gliales entériques (EGC), l'ENS régule des fonctions gastro-intestinales clés englobant la motilité, la sécrétion muqueuse, la prolifération cellulaire, la réparation tissulaire, mais aussi les fonctions immunitaires1. Des défauts dans l'organisation et les fonctions de l'ENS contribuent à divers dysfonctionnements gastro-intestinaux observés dans un large spectre de troubles digestifs et extra-digestifs2.

Au cours des dernières années, des techniques d'imagerie microscopique ont été développées pour mieux comprendre les fonctions de l'ENS dans des conditions normales et anormales. Par exemple, des progrès ont été réalisés en combinant des techniques microscopiques à haute résolution avec des sondes fluorimétriques telles que des colorants sensibles au calcium ou sensibles à la tension3. Un aperçu de l'organisation et de la vascularisation de l'ENS a également été fourni par des technologies telles que la microscopie à feuille de lumière et la tomographie par projection optique, qui permettent l'analyse de sections de quelques centimètres carrés de tissu digestif excisé4,5. Cependant, ces approches techniques ne peuvent être réalisées qu'ex vivo car elles nécessitent une compensation des tissus et une coloration immunohistochimique. La visualisation in vivo de l'ENS humain a été réalisée à l'aide d'une endomicroscopie confocale à sonde (pCLE), mais comme la résolution et la profondeur de pénétration étaient trop faibles, une dissection endoscopique sous-muqueuse6 ou une coloration au violet de crésyl6 était nécessaire pour obtenir une image claire de l'ENS7. Dans ce contexte, les nouvelles technologies fournissant une résolution spatiale élevée et une imagerie dynamique sans colorant de l'ENS présentent un grand intérêt.

À cet égard, la tomographie par cohérence optique (OCT) peut être très utile car elle permet l'imagerie des structures internes des tissus par analyse interférométrique de la lumière rétrodiffusée et réfléchie8. Cette technologie à grande vitesse et non invasive repose sur le contraste tissulaire inhérent pour créer une reconstruction volumétrique du tissu. Cette stratégie d'imagerie est la plus largement utilisée pour diagnostiquer les maladies de l'œil humain9, mais lorsqu'elle est combinée à une sonde à fibre optique, l'OCT pourrait acquérir des images dans le système cardiovasculaire, respiratoire ou digestif10. Dans l'intestin, l'OCT endoscopique a été généralement utilisé pour le diagnostic de l'œsophage de Barrett11 et des données préliminaires ont été obtenues pour d'autres indications telles que les maladies inflammatoires de l'intestin et le cancer colorectal12,13. L'OCT endomicroscopique in vivo avec une résolution typique de dizaines de microns14 a une résolution trop faible pour visualiser l'ENS, mais une résolution plus élevée peut être obtenue avec deux implémentations de cette technique : FFOCT15,16 et SD-OCT haute résolution17,18,19. Dans cet article, nous présentons les résultats obtenus avec le FFOCT, qui acquiert des images 2D en face à l'aide d'objectifs à grande ouverture numérique et de la lumière visible. Il permet la génération d'images avec une résolution micrométrique et subcellulaire et des données volumétriques peuvent également être collectées en modifiant la profondeur d'acquisition de l'image OCT en face. Son application a été principalement explorée pour la détection intra-procédurale des marges tumorales dans divers organes20, y compris le cerveau21. Il a également été rapporté pour l'imagerie des structures oculaires22,23. Malgré quelques premiers efforts24, le développement d'une version endoscopique de la FFOCT n'a pas encore abouti. Dans les échantillons ex vivo de l'intestin, le FFOCT a démontré sa capacité à imager le plexus myentérique dans le tractus gastro-intestinal de la souris et de l'homme25. Cependant, cette méthode d'imagerie ne visualise pas les neurones et les cellules gliales dans les ganglions entériques, en partie à cause des forts signaux de rétrodiffusion produits par les tissus environnants tels que les cellules musculaires ou par l'ENS et la présence d'un bruit de speckle. Un nouvel outil appelé FFOCT dynamique (D-FFOCT) a considérablement amélioré le contraste cellulaire dans les tissus complexes, en analysant les fluctuations temporelles de la lumière rétrodiffusée des tissus et des cellules26. Pour l'analyse temporelle du micromouvement des constituants cellulaires, qui est à la base du contraste intrinsèque du D-FFOCT, les signaux OCT sont collectés au fil du temps à partir du même plan d'imagerie, ce qui réduit également le bruit ajouté et améliore la qualité de l'image. Le contraste dynamique a également été mis en œuvre dans la technologie SD-OCT haute résolution, qui fournit des images en coupe transversale du tissu, par rapport au plan d'imagerie en face du D-FFOCT27. Micro-OCT avec contraste dynamique a été utilisé pour la visualisation de la micro-anatomie des voies respiratoires28, du col de l'utérus et de l'œsophage29. Les efforts récents se concentrent sur l'amélioration de la vitesse d'acquisition et de la qualité d'image du D-FFOCT et du micro-OCT avec un contraste dynamique pour permettre l'imagerie in vivo30,31,32. Dans le même temps, la technologie micro-OCT a été traduite avec succès en une conception endoscopique33,34. La conception préliminaire de l'endoscope micro-OCT avec le contraste dynamique a été présentée35 mais le défi de la stabilisation des tissus lors de l'acquisition de données longues nécessaires pour extraire le contraste dynamique reste une limitation majeure. Les mécanismes cellulaires sous-jacents aux fluctuations temporelles des signaux OCT restent également inconnus, mais des modifications de l'activité métabolique cellulaire pourraient être partiellement responsables, car l'inhibition de l'activité mitochondriale à l'aide de roténone ou de la glycolyse à l'aide de 2-désoxy-D-glucose a considérablement réduit l'intensité du signal OCT26. Fait intéressant, des cellules épithéliales ou immunitaires individuelles qui ne pouvaient pas être identifiées individuellement par FFOCT, pourraient être visualisées par D-FFOCT36. C'est encourageant mais à ce jour, rien n'est connu sur la capacité du D-FFOCT à imager l'ENS ou les mécanismes biologiques sous-jacents aux signaux D-FFOCT des cellules ENS.

Dans la présente étude, des segments excisés du côlon de souris adultes ont été analysés par FFOCT et D-FFOCT pour démontrer la capacité de cette technologie à imager les neurones et les cellules gliales dans le plexus myentérique, et pour mesurer les changements dans les signaux D-FFOCT liés à l'électrophysiologie neuronale. activité.

Pour déterminer si FFOCT peut être utilisé pour identifier les ganglions myentériques sans aucun marquage au colorant, des préparations entières de segments de côlon distaux de souris ont été épinglées sur un support Sylgard et imagées à l'aide de FFOCT. Les images ont été acquises à des profondeurs consécutives de 0,5 µm en commençant au niveau de la séreuse externe. Les couches musculaires longitudinale (Fig. 1a) et circulaire (Fig. 1c) ont été clairement identifiées car leurs fibres sont perpendiculaires entre elles. Fait intéressant, les dix à douze images FFOCT enregistrées entre les deux couches musculaires ont montré un réseau sombre délimité par des régions réfractaires (Fig. 1b). Pour confirmer que ces structures sombres correspondaient au plexus myentérique, des échantillons de tissus précédemment imagés par FFOCT ont été immunocolorés à l'aide d'anticorps dirigés contre Hu et S100β pour identifier respectivement les neurones et les cellules gliales entériques (Fig. 1d – f). En utilisant ces approches combinées, nous avons pu montrer que le FFOCT peut être utilisé pour identifier les structures formées par les ganglions et les faisceaux de fibres interganglionnaires depuis le réseau sombre observé dans le FFOCT superposé à la coloration Hu/S100β (Fig. 1f). Cependant, les neurones individuels et/ou les cellules gliales présentes dans le plexus myentérique n'ont pas pu être identifiés à l'aide de FFOCT.

a–c Le côlon des souris a été analysé par FFOCT au niveau d'un muscle longitudinal, b du plexus myentérique et c du muscle circulaire. Une zone sélectionnée du plexus myentérique a été visualisée par d FFOCT et par e apotome après l'immunomarquage des neurones (Hu en rouge) et des cellules gliales entériques (S100b en vert). L'image fusionnée (f) confirme que les zones sombres observées par FFOCT correspondent aux ganglions et aux faisceaux de fibres interganglionnaires. Barre d'échelle : a–c 200 µm ; d–f 100 µm.

Dans D-FFOCT, les images de la zone sélectionnée sont acquises au fil du temps permettant l'analyse des mouvements dans chaque voxel, et ainsi, fournissant un contraste supplémentaire qui permet de résoudre les cellules et le noyau. En utilisant cette approche, nous étions auparavant en mesure d'identifier des cellules épithéliales individuelles le long de l'intestin humain36. Ici, nous avons analysé les échantillons de tissus par D-FFOCT pour déterminer si cette technique peut être utilisée pour identifier les cellules individuelles dans les ganglions myentériques.

Comme illustré sur la Fig. 2, la comparaison des images FFOCT et D-FFOCT a clairement montré des structures qui n'étaient détectées que par le mode dynamique (Fig. 2a – f). Certaines de ces structures étaient probablement des noyaux individuels comme l'indiquent leur morphologie et leur localisation dans les ganglions. Les images D-FFOCT générées par le scanner Light-CT sont des images RVB pseudo-colorées où chaque canal de couleur est construit sur l'analyse dans le domaine de Fourier des micromouvements intégrés sur trois gammes de fréquences différentes. Les fréquences basses [0–0,6 Hz], moyennes [0,6–5,4 Hz] et hautes [5,4–25 Hz] ont été codées par couleur en bleu, vert et rouge, respectivement (Fig. 2g – i). Pour améliorer le contraste, visualiser et quantifier les informations fonctionnelles, les images RVB ont été découpées en images monochromes correspondant à leurs trois canaux de couleur. En utilisant cette approche, nous avons pu faire la distinction entre les structures ganglionnaires et extra-ganglionnaires en raison des différences d'intensité et d'amplitude du signal dans le tissu. Premièrement, l'amplitude de tous les signaux de fréquence était significativement plus élevée dans les structures ganglionnaires par rapport aux structures extra-ganglionnaires (Fig. 2j). De plus, dans les structures ganglionnaires, l'amplitude des signaux à haute fréquence était plus élevée que celle des signaux à basse fréquence. Ce n'était pas le cas dans les structures extra-ganglionnaires. Enfin, dans les deux structures, l'amplitude des signaux à moyenne fréquence était supérieure à celle des signaux à basse et haute fréquence.

a–d Micrographie de la région du plexus myentérique en FFOCT (a, b) ou D-FFOCT (c, d). b et d représentent un agrandissement de la zone pointillée en (a) et (c), respectivement. e, f Vue orthogonale des différents plans (x/y ; x/z et y/z) des images FFOCT (e) et D-FFOCT (f) z-stack (60 images). Les têtes de flèches indiquent la position de "l'image de face" dans la vue orthogonale. g–i La micrographie D-FFOCT en (c) est une image codée RVB dans laquelle le canal bleu (g) représente les basses fréquences [0–0,6 hertz], le canal vert (h) correspond aux fréquences moyennes [0,6– 5,4 hertz] et le canal rouge (i) aux hautes fréquences [5,4–25 hertz]. j L'intensité moyenne des fréquences basses (bleu), moyennes (vert bleuté) ou hautes (vermillon) a été déterminée dans les régions intra- et extra-ganglionnaires du plexus myentérique. Trois animaux ont été utilisés pour déterminer l'intensité moyenne +/- SEM et cinq régions indépendantes ont été analysées par animal. Statistique : test t bilatéral de Mann et Whitney. *p < 0,05 ; ***p < 0,001. Barre d'échelle : a, c, g–i, 125 µm ; b, d, 30 µm; e–f, x/y 30 µm, x/z et y/z 12 µm. Plexus myentérique MP, Mu muqueuse.

Comme première approche pour identifier les structures détectées par D-FFOCT dans le plexus myentérique, D-FFOCT a été combiné avec des méthodes histologiques et d'immunocoloration standard actuellement utilisées pour marquer les noyaux et caractériser les cellules du système nerveux entérique. À cette fin, des échantillons de tissus imagés par D-FFOCT ont été fixés et colorés avec du 4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI), un colorant fluorescent perméable aux cellules qui se lie à l'acide désoxyribonucléique (ADN). La superposition d'images D-FFOCT avec des micrographies confocales à haute puissance de coloration au DAPI a clairement montré que les structures de type nucléaire détectées dans le plexus myentérique par D-FFOCT correspondent à des noyaux marqués au DAPI (Fig. 3a – h). Fait intéressant, tous les noyaux n'ont pas pu être visualisés par D-FFOCT. Sur 261 noyaux marqués au DAPI comptés dans les ganglions myentériques, 27 n'ont pas été visualisés par D-FFOCT (tête de flèche blanche sur la Fig. 3e – h). Il est à noter qu'aucun noyau D-FFOCT n'a été détecté dans les régions extra-ganglionnaires alors que des cellules comme les cellules musculaires pourraient être présentes. Cette observation suggère un signal FFOCT dépendant de la cellule ou de la morphologie.

a–d Image fusionnée (c, d) des micrographies D-FFOCT (a) et confocales colorées au DAPI (b). La même région du plexus myentérique de souris a été analysée et comparée. En d, seule l'image haute fréquence (rouge) de D-FFOCT a été superposée à l'image confocale DAPI (blanche) pour voir clairement la colocalisation du signal. Barre d'échelle : 25 µm. e–h agrandissement de la zone pointillée en (a–d). La pointe de flèche pointe un noyau DAPI-positif qui n'est pas détecté par D-FFOCT. Barre d'échelle : 10 µm. i–k Micrographie des mêmes ganglions visualisés par D-FFOCT (i) ou par apotome après immunocoloration Hu (j) ou S100b (k). Les cellules Hu et S100b chevauchant les noyaux positifs D-FFOCT ont été identifiées par des flèches et des pointes de flèches, respectivement. Barre d'échelle : 25 µm. l–n Image fusionnée de micrographies confocales haute fréquence D-FFOCT (rouge), Dapi (blanc) et Hu (l ; vert) ou S100b (m, jaune) d'un ganglion myentérique de souris. Dans les mêmes ganglions, des noyaux D-FFOCT positifs (têtes de flèches simples) et négatifs (têtes de flèches doubles) ont été indiqués. Les pointes de flèche orange et les doubles pointes de flèche pointaient les noyaux D-FFOCT co-localisés avec Hu tandis que la pointe de flèche blanche et la double pointe de flèche indiquaient les noyaux D-FFOCT co-localisés avec S100b. Barre d'échelle : 25 µm. o Distribution taille-fréquence des noyaux D-FFOCT-positifs co-localisés avec la coloration Hu ou S100b. 344 noyaux ont été analysés dans 13 ganglions de 3 souris (regroupés dans une plage de 10 µm2). p Surface moyenne en µm2 des noyaux neuronaux (Neu, n = 219) ou gliaux (EGC ; n = 125) D-FFOCT-positifs. Valeur moyenne +/− SEM ; Statistique : test t bilatéral de Mann et Whitney. q Intensité moyenne des noyaux neuronaux (Neu, n = 219) ou gliaux (EGC, n = 125)) pour les fréquences basses (bleu), moyennes (vert bleuâtre) ou hautes (vermillon). Valeur moyenne +/− SEM ; Statistique : test t bilatéral de Mann et Whitney. *p < 0,05 ; **p < 0,01, ***p < 0,001.

Pour caractériser les cellules avec des noyaux D-FFOCT-positifs, les tissus ont ensuite été fixés, immunocolorés à l'aide d'anticorps contre des marqueurs neuronaux (Hu) ou gliaux (S100β), et analysés par microscopie à fluorescence apotome. Comme illustré sur la Fig. 3i – k, la grande majorité des structures de type nucléaire observées par D-FFOCT se chevauchaient avec la coloration Hu (flèches) ou S100β (tête de flèche). La superposition des images D-FFOCT à celles obtenues par microscopie confocale après immunohistochimie et coloration DAPI (Fig. 3l, m) a révélé que des structures nucléaires D-FFOCT étaient détectées dans des cellules Hu-positives DAPI (têtes de flèches orange sur Fig. 3l , n). Comme l'indiquent les têtes de double flèche orange, peu de neurones Hu-positifs DAPI ne présentaient pas de structures nucléaires D-FFOCT. Concernant les cellules gliales, des structures nucléaires D-FFOCT ont été détectées dans une grande majorité de cellules gliales positives au DAPI S100β (têtes de flèches blanches sur la Fig. 3m, n) mais certaines cellules positives au DAPI S100β n'étaient pas visibles par D -FFOCT (têtes de flèches doubles blanches sur la Fig. 3m, n). Le comptage cellulaire a montré que les structures nucléaires détectées par D-FFOCT étaient présentes dans 96 % des neurones (163 noyaux sur 170) et 78 % des EGC (71 noyaux sur 91) contenant des noyaux DAPI-positifs.

Pour déterminer si la morphologie et/ou l'intensité RGB des structures nucléaires D-FFOCT pouvaient être utilisées pour discriminer les noyaux des neurones et des cellules gliales, leur distribution de taille a été analysée. Les résultats ont révélé des distributions gaussiennes. Pour les cellules gliales, le pic était localisé sur la partie gauche de l'histogramme qui correspondait aux petits noyaux tandis que pour les neurones, le pic était plus à droite ce qui correspondait aux gros noyaux (Fig. 3o). Cette observation est étayée par le fait que la surface moyenne des structures nucléaires EGC D-FFOCT était presque deux fois plus petite que la surface moyenne des structures nucléaires neuronales D-FFOCT (49,9 µm² +/- 15,8 vs 89,9 µm² +/- 17,9, respectivement ; moyenne +/- SD) (Fig. 3p). Fait intéressant, nous avons montré qu'une valeur de coupure de 65 µm2 nous permettait de discriminer 78,4 % de l'EGC et 92,7 % des neurones dans les fractions inférieures et supérieures à 65 µm2, respectivement. Les amplitudes des fréquences D-FFOCT ont été comparées. Les résultats ont indiqué que l'intensité moyenne de tous les signaux de fréquences était significativement plus élevée dans les neurones par rapport aux cellules gliales (Fig. 3q).

Pour déterminer si les signaux D-FFOCT pouvaient être modulés par l'activité neuronale, des images de l'ensemble des ganglions ont été acquises par D-FFOCT avant et 30 min après l'ajout de vératridine, un activateur du canal Na (Fig. 4a).

une micrographie D-FFOCT des mêmes ganglions visualisés avant (T0) et après un traitement de 30 min avec 75 µM de vératridine (T1). Barre d'échelle : 30 µm. b, c Rapport T1:T0 exprimé en pourcentage de l'intensité moyenne pour la plage de fréquence basse (bleu), moyenne (vert bleuâtre) ou élevée (vermillon) après un traitement avec un véhicule (0,1 % vol/vol DMSO) ou 75 µM vératridine (Vera). L'intensité moyenne a été calculée à partir de l'ensemble des ganglions (b) ou de la structure nucléaire (c) comme indiqué dans la partie supérieure du panneau. d, e Même expérience qu'en (c) mais les noyaux ont été subdivisés en fonction de leur taille >65 µm (d) et <65 µm (e). Veratridine, n = 20 ganglions de 4 souris ; DMSO, n = 20 (b, d) ou 18 (c, e) ganglions de 4 souris. Valeur moyenne +/− SEM ; Statistique : test t bilatéral de Mann et Whitney. *p < 0,05 ; **p < 0,01, ***p < 0,001.

L'intensité moyenne pour les gammes de fréquences basses, moyennes et hautes a ensuite été analysée. Comme observé sur la Fig. 4b, la vératridine a induit une augmentation de l'intensité des signaux haute et moyenne fréquence et une réduction significative de l'intensité des signaux basse fréquence dans l'ensemble des ganglions par rapport au témoin (Fig. 4b, 5 ganglions par animal par condition prélevé sur 4 animaux, témoin : DMSO 0,1% vol/vol). L'impact de la vératridine sur les signaux D-FFOCT a ensuite été examiné au niveau d'un seul noyau. Par rapport au témoin, une augmentation de l'intensité des signaux à moyenne et à haute fréquence a été observée dans les noyaux traités à la vératridine alors qu'aucun changement n'a été remarqué pour les basses fréquences (Fig. 4c, 100 à 300 noyaux par animal chez 4 animaux). Fait intéressant, certains signaux nucléaires D-FFOCT qui n'ont pas été détectés dans des conditions basales ont été observés dans les noyaux traités à la vératridine (Fig. 1a supplémentaire, flèches). Pour déterminer si les changements dans les signaux D-FFOCT étaient dépendants du type de cellule, les résultats ont été classés en fonction de la valeur seuil de taille nucléaire qui discrimine les cellules neuronales (taille nucléaire > 65 µm2) et gliales (taille nucléaire < 65 µm2). Par rapport au contrôle, le traitement à la vératridine a augmenté de manière significative l'intensité des signaux à moyenne et à haute fréquence dans la population cellulaire de taille nucléaire> 65 µm2, ce qui correspondait principalement aux neurones (Fig. 4d). La vératridine a également induit une augmentation significative de l'intensité des signaux haute fréquence dans la population cellulaire de taille de noyau <65 µm2, principalement constituée de cellules gliales (Fig. 4e). Enfin, les modifications des signaux D-FFOCT induites par la vératridine ont été inversées après lavage avec une solution de Krebs (Fig. 1b, c supplémentaires).

Comme l'activité neuronale modulait les signaux D-FFOCT dans les cellules neuronales et gliales, nous avons examiné si l'inhibition pharmacologique de l'activité neuronale basale avec la tétrodotoxine (TTX) avait un impact sur les signaux D-FFOCT (Fig. 5a). L'analyse de l'ensemble des ganglions après traitement au TTX a révélé que la toxine ne modifiait pas l'intensité des signaux de moyenne ou haute fréquence mais réduisait significativement l'intensité des signaux de basse fréquence (Fig. 5b). De plus, aucun changement significatif des signaux de fréquence D-FFOCT n'a été observé dans les structures nucléaires après traitement avec TTX (Fig. 5c).

une micrographie D-FFOCT des mêmes ganglions avant (T0) et après un traitement de 30 min avec 1 µM de tétrodotoxine (T1). Barre d'échelle : 30 µm. b, c Rapport T1:T0 en pourcentage de l'intensité moyenne pour une plage de fréquence faible (bleu), moyenne (vert bleuâtre) ou élevée (vermillon) pour un traitement avec véhicule (Krebs) ou tétrodotoxine (TTX). L'intensité moyenne a été calculée à partir de l'ensemble des ganglions (b) ou de la structure nucléaire (c). Tétrodotoxine, n = 25 ganglions de 5 souris ; Krebs, n = 15 ganglions de trois souris. Valeur moyenne +/− SEM ; Statistique : test t bilatéral de Mann et Whitney. **p < 0,01.

Les observations selon lesquelles l'activité neuronale accrue modulait les signaux D-FFOCT dans les noyaux neuronaux et gliaux nous ont incités à étudier plus avant les mécanismes putatifs sous-jacents à ces changements. De manière intéressante, il a été montré que l'activité neuronale est associée à des modifications de la morphologie nucléaire dues à des changements dans l'activité transcriptionnelle37. Parmi les autres facteurs connus pour réguler la morphologie nucléaire figure également le stress osmotique38,39. En particulier, il a été démontré que l'hyperosmolarité induisait un rétrécissement nucléaire ou contractait la morphologie nucléaire et, putativement, altérait ses propriétés vibrationnelles dont les modifications pourraient être détectées avec D-FFOCT.

Pour valider cette hypothèse, nous avons analysé si le changement de pression osmotique avait un impact sur les signaux D-FFOCT dans les cellules ENS (Fig. 6a). Fait intéressant, l'augmentation de la concentration de mannitol a induit une diminution significative de l'intensité des signaux D-FFOCT pour les basses, moyennes et hautes fréquences dans les ganglions (Fig. 6b) mais également dans le noyau des cellules ganglionnaires (Fig. 6c). Cet effet était réversible puisque les signaux D-FFOCT dans les ganglions (Fig. 2b supplémentaire) et dans les noyaux (Fig. 2c supplémentaire) sont revenus à leur valeur initiale après lavage avec la solution de Krebs (Fig. 2a supplémentaire).

une micrographie D-FFOCT des mêmes ganglions avant (T0) et après un traitement de 30 min avec le véhicule (Krebs), 100, 200 ou 300 mM de mannitol (T1). Barre d'échelle : 25 µm. b, c Rapport T1:T0 en pourcentage de l'intensité moyenne pour la plage de fréquence basse (bleu), moyenne (vert bleuâtre) ou haute (vermillon) pour un traitement avec véhicule (Krebs, 0) ou 100, 200, 300 mM de mannitol. L'intensité moyenne a été calculée à partir de l'ensemble des ganglions (b) ou de la structure nucléaire (c). n = 15 ganglions de 3 souris. Valeur moyenne +/− SEM ; Statistique : pour chaque couleur, test bilatéral de Kruskal-Wallis suivi d'un Dunn's. *p < 0,05 ; **p < 0,01, ***p < 0,001.

Dans la présente étude, nous avons montré que l'analyse temps-fréquence des signaux OCT ou D-FFOCT permettait l'identification in situ des neurones entériques et des cellules gliales dans des préparations de côlon de souris. Les fréquences des signaux OCT dans les noyaux des neurones entériques et de la glie étaient plus élevées que celles enregistrées dans les régions extra-ganglionnaires et, fait intéressant, des stimuli externes tels que l'activation neuronale ou l'hyperosmolarité induisaient des changements réversibles dans les fluctuations du signal OCT. À l'avenir, l'utilisation de cette technique pourrait apporter de nouvelles connaissances sur les changements des fonctions entériques et gliales dans la santé et les maladies.

Le mode d'imagerie FFOCT a révélé des structures peu réfléchissantes à l'interface entre les muscles longitudinaux et circulaires, qui ont été identifiées par immunohistochimie comme étant le plexus myentérique. Des résultats similaires ont déjà été obtenus chez la souris en utilisant les techniques OCT, permettant la détection de changements dans la densité des ganglions myentériques dans des modèles animaux de la maladie de Hirschsprung25. L'imagerie FFOCT a également montré des structures hautement réfractives correspondant aux ganglions à l'interface entre les muscles longitudinaux et les ganglions myentériques (Fig. 1a). Ces structures hautement réfringentes sont éventuellement formées de composés riches en collagène, molécules importantes pour l'adhésion des ganglions aux muscles longitudinaux40. Fait intéressant, la composition de cette matrice extracellulaire est altérée dans des conditions pathologiques telles que la maladie inflammatoire de l'intestin41 ou la maladie de Hirschsprung42. Par conséquent, FFOCT pourrait être un outil intéressant pour détecter les changements dans la composition de la matrice extracellulaire. À cet égard, nous avons récemment montré une réduction des signaux FFOCT hautement réfléchissants dans la muqueuse colique des patients atteints de spina bifida qui étaient corrélés à une diminution significative de l'intensité de la coloration au rouge Sirius, un marqueur des dépôts de collagène43.

La FFOCT ne nous a pas permis de visualiser des cellules individuelles dans les ganglions myentériques, contrairement à d'autres études25. Cet écart peut s'expliquer par des différences technologiques telles que l'objectif ou l'intensité de la source lumineuse entre le système FFOCT commercial que nous avons utilisé (Light CT-scanner, LLTech), mais le D-FFOCT offre la possibilité d'imager des cellules individuelles sur toute l'épaisseur du tissu intestinal, en particulier dans des structures bien définies telles que le plexus myentérique et la couche de cellules épithéliales. Ainsi, cette approche technique a été récemment utilisée pour discriminer les cellules épithéliales dans les biopsies humaines des différentes parties du tractus intestinal36. De plus, D-FFOCT offre la possibilité d'intégrer les mouvements subcellulaires et fournit des images en fonction de l'intensité des fréquences émises. Les composants subcellulaires tels que les noyaux, caractérisés par des fréquences moyennes et élevées élevées, étaient clairement visibles par D-FFOCT dans les ganglions myentériques, et l'analyse immunohistochimique a indiqué que ces noyaux correspondaient à des neurones ou à des cellules gliales. Fait intéressant, 96% des neurones intraganglionnaires étaient visibles par D-FFOCT alors que peu ou pas d'éléments cellulaires étaient discernés par D-FFOCT dans les régions extra-ganglionnaires ou dans les couches musculaires. Comme le signal D-FFOCT pourrait être lié à l'activité métabolique des structures subcellulaires en mouvement, on pourrait émettre l'hypothèse que ces différences sont la conséquence d'un niveau différent d'activité métabolique dans les cellules. L'étude de la séparation de fréquence optimale entre trois canaux de couleur pourrait être intéressante pour améliorer encore la visualisation de l'ENS. De plus, une certaine inadéquation a pu être observée dans la forme et les positions des noyaux entre D-FFOCT et les images confocales après immunocoloration. Cela est probablement dû aux déformations induites par le processus de fixation et de coloration entre les deux acquisitions, que nous choisissons de négliger, et à l'erreur de recalage en elle-même qui ne peut être évitée en raison de la résolution de l'image44. En effet, l'enregistrement a été effectué de manière rigide, sans aucune déformation autorisée, afin d'éviter un gauchissement biaisé des formes. Cette contrainte rigide nous a permis d'affirmer avec confiance que ce sont les noyaux et non les cellules qui peuvent être observés dans D-FFOCT, mais a conduit au petit décalage observé.

Dans la présente étude, nous avons également démontré que les signaux D-FFOCT dans les neurones et les cellules gliales pouvaient être modifiés par des stimuli externes. Nous avons d'abord montré que l'hyperosmolarité diminuait les signaux nucléaires FFOCT de manière réversible. Fait intéressant, l'hyperosmolarité est connue pour altérer la liaison des protéines à l'ADN et pour induire un processus de condensation réversible de l'ADN comparable à la mitose45. Par conséquent, la diminution réversible des signaux D-FFOCT suite à l'ajout d'une concentration croissante de mannitol pourrait être due à un mouvement réduit de l'ADN dû à la condensation de l'ADN du noyau. Outre l'osmolarité, nous avons cherché à déterminer l'impact de l'activité neuronale sur les signaux D-FFOCT, car une activité neuronale accrue active l'activité transcriptionnelle dans les neurones, notamment via des voies intracellulaires telles que les protéines kinases activées par les mitogènes46. En effet, le changement des états de la chromatine dépendants de l'activité pourrait avoir un impact sur l'état vibrationnel du noyau. Ici, nous avons rapporté que la stimulation de l'activité neuronale avec la vératridine a déclenché une augmentation des signaux D-FFOCT à moyenne et haute fréquence dans les noyaux des neurones et des cellules gliales présentes dans les ganglions myentériques. Bien que les cellules gliales ne soient pas directement activées par la vératridine, l'augmentation du signal D-FFOCT pourrait être la conséquence d'interactions neuro-gliales consécutives à l'activation neuronale. Fait intéressant, des noyaux non détectés dans les ganglions myentériques dans des conditions basales ont été observés après traitement à la vératridine (Fig. 1 supplémentaire). Une telle induction n'a pas été observée suite à des stimuli hyperosmolaires. De plus, les raisons sous-jacentes au fait qu'aucun changement significatif des signaux de fréquence D-FFOCT n'a été observé dans les structures nucléaires après traitement avec TTX restent inconnues. Cela pourrait cependant être dû au fait que dans des conditions basales, l'activité neuronale est faible, de sorte que l'ajout de TTX n'induirait que de petits changements d'activité qui ne pourraient pas être détectés avec notre système. Des investigations supplémentaires sont nécessaires pour comprendre la base moléculaire des signaux D-FFOCT dans les ganglions myentériques, mais nos données suggèrent que des changements dans l'état vibrationnel des noyaux pourraient être liés à la condensation de l'ADN nucléaire et/ou à la variation de l'activité transcriptionnelle.

Notre présente étude fournit la première démonstration que le D-FFOCT pourrait être utilisé pour imager et identifier in situ les cellules neuronales et gliales du plexus myentérique. Les changements dans les fréquences vibratoires des noyaux en réponse à des stimuli physiologiques et non physiologiques suggèrent que le D-FFOCT pourrait également être utile pour analyser l'activité cellulaire et détecter une fonction cellulaire anormale.

Des souris mâles C57BL/6J Rj âgées de 8 à 12 semaines (Laboratoire Janvier, Le Genest-Saint-Isle, Fr) ont été logées dans un cycle lumière/obscurité de 12 h avec un accès ad libitum à la nourriture et à l'eau. Les enquêteurs ont été accrédités par l'Agence nationale vétérinaire française et les expériences ont été menées dans le strict respect des recommandations du Comité local de protection et d'utilisation des animaux de Nantes (France). Après une période d'adaptation d'une semaine, les animaux ont été sacrifiés par dislocation cervicale pour la collecte de tissus. L'intestin entier de chaque souris a été rapidement excisé et placé dans une solution de Krebs glacée (NaCl, 117 mM ; KCl, 4,7 mM ; MgCl2, 1,2 mM ; NaH2PO4, 1,2 mM ; NaHCO3, 25 mM ; CaCl2, 2,5 mM ; glucose, 11 mM).

Des tissus intestinaux de souris adultes ont été prélevés, lavés avec une solution froide de Krebs et coupés en petits morceaux. Ensuite, des segments de côlon distal ont été ouverts longitudinalement le long du mésentère, étirés et épinglés sur Sylgard (Dow Corning, Midland, MI) adapté pour le porte-échantillon.

Les images FFOCT et D-FFOCT ont été réalisées à l'aide du scanner Light-CT (LLtech, Paris, Fr) placé sur une table anti-vibratoire (CleanBench with Gimbal Piston vibration isolation, Photon Lines SAS, St Germain-en-Laye, Fr). La plaque de support Sylgard a été placée dans le support du scanner avec suffisamment de solution pour éviter le dessèchement. Après avoir éclairé l'échantillon avec une source de lumière halogène, la lumière réfléchie par l'échantillon a interféré avec la lumière du bras de référence dans l'interféromètre de Linnik, avant d'être détectée par une caméra mégapixel. Des images "en face" bidimensionnelles (2D) ont été collectées avec un champ de vision de 1,25 mm × 1,25 mm et une taille de voxel de 1 µm × 1 µm × 1 µm. Le système a permis l'exploration de la profondeur de l'échantillon jusqu'à environ 150 µm de profondeur. Pour D-FFOCT, 1000 images à 300 Hz ont été collectées (images de l'interféromètre de sortie toutes les 3,3 ms pendant 3,3 s). Pour améliorer les performances signal sur bruit, une moyenne sans chevauchement de quatre images a été appliquée comme filtre passe-bas pour atténuer efficacement les fréquences plus élevées et, à son tour, supprimer le bruit tout en mesurant plus de photons. Pour maximiser le rapport signal/bruit dans le scanner Light-CT commercial, les bandes d'intégration RVB sont préréglées sur le canal bleu basse fréquence (0–0,6 Hz), le canal vert moyenne fréquence (0,6–5,4 Hz) et le canal haut -canal rouge de fréquence (5,4–25 Hz).

Après imagerie FFOCT, les échantillons de côlon ont été fixés dans du paraformaldéhyde à 4% dans du PBS pendant 3 h à température ambiante, lavés et stockés dans du PBS NaN3 (1 g par litre) jusqu'à utilisation. La perméabilisation a été obtenue en incubant les tissus pendant 48 h à 36 h dans du PBS NaN3 additionné de 10 % de sérum de cheval, 3 % de triton X100 et 0,05 % de saponine à 4 °C sous agitation. Ensuite, les échantillons ont été incubés pendant 24h dans un tampon perméabilisé avec des anticorps primaires anti-Hu (anticorps monoclonal humain à 1:500, cadeau) et anti-S100b (polyclonal de lapin à 1:3, Dako Agilent, Santa Clara, USA) à température ambiante sous agitation. Après lavage, les échantillons ont été incubés pendant 5 h dans un tampon perméabilisé avec des anticorps secondaires chèvre anti-lapin Cy5 dilué au 1:500 (Jackson Immuno Research, Cambridge House, UK) et âne anti-humain Cy3 dilué au 1/500 (Jackson Immuno Research ) à température ambiante sous agitation. Après lavage, une contre-coloration nucléaire a été effectuée pendant 10 min à température ambiante, à l'aide de DAPI (1:1000 dans du PBS Sigma-Aldrich, Saint Louis, États-Unis) et les échantillons ont été montés entre la lame et la lame de couverture avec un milieu de montage antifading (Prolong gold antifade, Thermofisher , Waltham, États-Unis).

Les échantillons ont été visualisés à l'aide de l'AxioZoom.V16 fluorescent (Zeiss, Marly le Roi, Fr) associé à Apotome2. Des images confocales ont également été obtenues à l'aide du microscope confocal Nikon A1 RSi (Nikon SAS, Champigny sur Marne, Fr) avec deux objectifs 60x et 20x. Les images de FFOCT et d'apotome ont été alignées à l'aide du plugin "Align Image by line ROI" T. 3D D-FFOCT (logiciel Fiji)47 tandis que les images confocales 3D ont été alignées à l'aide du logiciel ICY48 comme décrit ci-dessous.

Les images de D-FFOCT ont été alignées à l'aide de ec-clemv244 sous ICY.

Afin d'évaluer avec précision le contenu de D-FFOCT au niveau cellulaire, l'enregistrement a été effectué en 3D pour prendre en compte le changement de pose de l'échantillon entre les deux systèmes, et en supposant de manière rigide que la déformation tissulaire sera négligeable à cette échelle. Après l'imagerie D-FFOCT (Fig. 3a supplémentaire), les échantillons ont été imagés sur le confocal Nikon A1R à 20x pour obtenir une image de référence facilitant l'identification de la zone d'intérêt (Fig. 3e supplémentaire). Ensuite, une pile sur un champ de vision arbitraire a été acquise à 60x (Fig. 3f supplémentaire). La projection d'intensité maximale du 20x a d'abord été enregistrée manuellement dans le D-FFOCT en utilisant la structure d'intérêt et en définissant la contrainte pour qu'il n'y ait aucune mise à l'échelle ou aucune déformation dans la transformation (seules la rotation et la translation sont autorisées). Cela donne la matrice de transformation 2D de 20x à D-FFOCT. Même si le nombre de pixels dans les deux images était très différent, ec-clemv2 a utilisé la taille du pixel pour calculer la transformation dans l'unité du micromètre, sur la base des métadonnées des images fournies par les instruments nous permettant de contraindre la transformation à être rigide. La projection d'intensité maximale de l'acquisition confocale 60x a été automatiquement trouvée dans la projection d'intensité maximale 20x à l'aide de la partie Autofinder d'ecclemv2. à l'aide d'un protocole glacial adapté. Cela donne la transformation 2D de 60x à 20x. Ces transformations ont été combinées afin de calculer à l'aide de la fonction de transformation en cascade d'ecclemv2 et ont été inversées pour donner la transformation D-FFOCT en 60x 2D. Cette transformation a été appliquée à la pile complète D-FFOCT et a servi d'initialisation pour l'enregistrement rigide 3D basé sur le centre sélectionné manuellement de ce qui était supposé correspondre à certains noyaux (environ 10 points localisés en 3D dans les deux images). La contrainte rigide nous a permis de ne pas déformer les images et de vérifier le bon appariement des noyaux non utilisés pour le recalage.

Pour discriminer et quantifier chaque taille nucléaire des cellules neuronales et gliales, des images D-FFOCT et des images d'apotome ont été superposées avec l'algorithme "Align Image by line ROI plugin" de FIJI.

Pour l'analyse nucléaire, des masques ont été créés à partir des images D-FFOCT à l'aide du plugin WEKA aux Fidji. Les masques diviseraient les images rouges, vertes et bleues. Les ROI 2D, avec des paramètres d'intensité moyenne, ont ensuite été analysés pour chaque compartiment. Nous avons déterminé l'intensité de la valeur moyenne de 125 noyaux gliaux et 219 noyaux de neurones.

Après marquage des zones à analyser, chaque échantillon de tissu épinglé sur Sylgard a été imagé par D-FFOCT avant traitement (T0). L'échantillon a ensuite été retiré de la plaque de support, placé dans des plaques de culture cellulaire à 6 puits et traité avec 75 µM de vératridine (Sigma-Aldrich, Saint Louis, USA), 1 µM de TTX (Bio-Techne SAS, Noyal-Châtillon sur Seiche , France), 100 mM, 200 mM et 300 mM de D-Mannitol (Sigma-Aldrich), 0,1% (vol/vol) DMSO (vératridine contrôle) ou Krebs (TTX et Mannitol contrôle) pendant 30 min à température ambiante sous agitation (200 tr/min). Ensuite, chaque échantillon de tissu traité épinglé sur Sylgard a été remis sur le support du scanner avec la même pression et la même localisation (X, Y) pour être imagé par D-FFOCT (T1). Chaque échantillon de tissu a ensuite été lavé deux fois 15 min chacun et imagé à nouveau par D-FFOCT (T2).

Les images D-FFOCT des ganglions acquises avant le traitement (T0), après le traitement chimique (T1) et après le lavage (T2) ont été alignées à l'aide de la "fonction d'alignement" aux Fidji.

Pour l'ensemble de l'analyse des ganglions, les ganglions observés à T0 ont été entourés manuellement pour créer un masque qui a été signalé pour diviser les images rouges, vertes et bleues acquises à T0, T1 et T2 et mesurer l'intensité moyenne dans l'ensemble des ganglions. Le bleu correspond à la basse fréquence (LF, 0–0,6 Hz), le vert à la fréquence moyenne (MF, 0,6–5,4 Hz) et le rouge à la haute fréquence (HF, 5,4–25 Hz).

Pour l'analyse nucléaire, des masques ont été créés à partir des images acquises à T0 à l'aide du plugin WEKA49 aux Fidji (Fig. 4 supplémentaire). Les masques diviseraient les images rouges, vertes et bleues. L'intensité moyenne de chaque noyau a été calculée à T0, T1 et T2. Lorsque les résultats ont été exprimés en pourcentage de T0, les valeurs ont été calculées pour chaque noyau et les valeurs moyennes par ganglion ont été utilisées.

Le nombre d'expériences indépendantes est spécifié dans les légendes des figures. La signification statistique a été déterminée à l'aide du test t bilatéral non paramétrique de Mann et Whitney ou du test bilatéral de Kruskal-Wallis suivi d'un test de Dunn. Toutes les analyses statistiques ont été effectuées à l'aide de GraphPad Prism (GraphPad Prism 8.0, logiciel GraphPad Inc) et les différences avec une valeur p de 0,05 ou moins ont été considérées comme statistiquement significatives. *P < 0,05 ; **P < 0,01 ; ***P < 0,001.

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports sur le portefeuille Nature lié à cet article.

Les données numériques générées ou analysées au cours de cette étude sont incluses dans cet article publié (et son fichier de données supplémentaires). Les micrographies présentées dans la présente étude sont disponibles dans le référentiel [OMERO] [https://omero.os-bird.glicid.fr/webclient/?show=project-315 login : guest_user password : Welcome!1].

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Ce travail a été soutenu par Mibiogate (Convention 2016-11179) de la Région Pays de la Loire et la Fondation SantéDige. Nous reconnaissons l'installation IBISA MicroPICell (Biogenouest), membre de l'infrastructure nationale France-Bioimagerie soutenue par l'Agence Nationale de la Recherche (ANR-10-INBS-04). PP-G. est soutenu par l'ANR CROCOVAL (ANR-18-CE45-0015).

Ces auteurs ont dirigé conjointement ce travail : Michel Neunlist, Philippe Naveilhan.

Université de Nantes, CHU Nantes, Inserm, TENS, Le système nerveux entérique dans les maladies intestinales et cérébrales, IMAD, Nantes, France

Tony Durand, Lara Laboudie, Emmanuel Coron, Isabelle Neveu, Michel Neunlist & Philippe Naveilhan

Nantes Université, CNRS, INSERM, l’institut du thorax, F-44000, Nantes, France

Perrine Paul-Gilloteaux

Nantes Université, CHU Nantes, Inserm, CNRS, SFR Santé, Inserm UMS 016, CNRS UAR 3556, F-44000, Nantes, France

Perrine Paul-Gilloteaux

Wyss Center for Bio and Neuroengineering, Campus Biotech, Genève, Suisse

Michalina Gora

Laboratoire ICube, CNRS, Université de Strasbourg, Strasbourg, France

Michalina Gora

Service de gastro-entérologie et hépatologie, Hôpitaux universitaires de Genève (HUG), rue Gabrielle Perret-Gentil 4, 1211, Genève, 1205, Suisse

Emmanuel Coron

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MN, PN et TD contribuent au design, à la conception et à l'interprétation de l'œuvre ; TD, LL, PP-G. et PN ont acquis, analysé et interprété les données ; TD, PN et MN ont rédigé le MS ; PP-G., MG, EC et IN révision critique du manuscrit.

Correspondance à Michel Neunlist.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Communications Biology remercie Chao Ren et les autres examinateurs anonymes pour leur contribution à l'examen par les pairs de ce travail. Rédacteurs en chef de la manipulation principale : Chao Zhou et Manuel Breuer.

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Réimpressions et autorisations

Durand, T., Paul-Gilloteaux, P., Gora, M. et al. Visualisation de l'activité du système nerveux entérique grâce à la tomographie par cohérence optique plein champ dynamique sans colorant. Commun Biol 6, 236 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-04593-9

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Reçu : 19 août 2022

Accepté : 14 février 2023

Publié: 02 mars 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s42003-023-04593-9

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Visualisation de l'activité du système nerveux entérique à travers le colorant