Monocyte

Rapports scientifiques volume 5, Numéro d'article : 15857 (2015) Citer cet article

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La nicotinamide phosphoribosyltransférase (Nampt) catalyse l'étape limitante dans la voie de récupération pour la biosynthèse du nicotinamide adénine dinucléotide (NAD+) et régule ainsi l'activité désacétylase des sirtuines. Ici, nous montrons la régulation accommodative du NAD + myocardique par Nampt extracellulaire dérivé de monocytes (eNampt), qui est essentiel pour la compensation hémodynamique de la surcharge de pression. Bien que l'expression intracellulaire de Nampt (iNampt) ait diminué dans les cœurs en surcharge de pression, la concentration myocardique de NAD + et l'activité de Sirt1 ont été préservées. En revanche, iNampt était régulé positivement dans la rate et les monocytes et la protéine eNampt circulante et le mononucléotide nicotinamide (NMN), un précurseur clé du NAD+, étaient significativement augmentés. L'inhibition pharmacologique de Nampt par FK866 ou la déplétion des monocytes/macrophages par les liposomes de clodronate ont perturbé le mécanisme homéostatique des niveaux myocardiques de NAD+ et de l'activité Sirt1 dépendante de NAD+, entraînant une susceptibilité à l'apoptose des cardiomyocytes et à la décompensation cardiaque chez les souris en surcharge de pression. Ces défauts biochimiques et hémodynamiques ont été prévenus par l'administration systémique de NMN. Nos études révèlent un rôle crucial de l'eNampt dérivé des monocytes dans l'adaptation du myocarde à la surcharge de pression et mettent en évidence une intervention potentielle contrôlant le NAD+ myocardique contre l'insuffisance cardiaque.

Le nicotinamide adénine dinucléotide (NAD+) est un cofacteur de l'oxydoréductase pour de nombreuses réactions métaboliques telles que la glycolyse, la β-oxydation des acides gras, le cycle TCA et la phosphorylation oxydative mitochondriale1. Le NAD+ fonctionne également comme un substrat essentiel pour des enzymes telles que les poly(ADP-ribose) polymérases2 et les sirtuines3. Les sirtuines sont des enzymes dépendantes du NAD+ qui catalysent la désacétylation des histones et une grande variété de protéines dans plusieurs compartiments cellulaires4 et les sirtuines de mammifères (comprenant Sirt1-Sirt7) agissent comme des régulateurs essentiels du maintien de l'homéostasie énergétique et de la prévention des maladies liées au vieillissement4. En conséquence, une régulation stricte des niveaux intracellulaires de NAD+ est essentielle pour la survie cellulaire et de l'organisme dans des conditions physiopathologiques. Le NAD+ peut être synthétisé de novo, mais la majorité du NAD+ est synthétisée par la voie de récupération à partir de ses précurseurs, l'acide nicotinique, le nicotinamide (NAM) ou le NAM ribose5. Dans les cellules de mammifères, la conversion de NAM en mononucléotide NAM (NMN) par la NAM phosphoribosyltransférase (Nampt) est l'étape limitant la vitesse de cette voie6. Curieusement, Nampt existe non seulement sous une forme intracellulaire (iNampt) mais aussi sous une forme extracellulaire (eNampt) dans un dimère enzymatiquement actif7 et eNampt, précédemment appelé facteur d'amélioration des colonies de cellules pré-B ou visfatine, est produit et sécrété par les adipocytes, les cellules mononucléaires, les hépatocytes et les cardiomyocytes7-9. Une concentration élevée de NMN est présente dans le plasma de souris et la production extracellulaire de NMN médiée par eNampt régule la biosynthèse intracellulaire du NAD+ dans les tissus métaboliques tels que le foie et le tissu adipeux blanc chez les souris diabétiques induites par un régime riche en graisses10.

Dans le cœur, le niveau d'expression de la protéine Nampt était régulé à la baisse dans des conditions pathologiques telles que l'ischémie, l'ischémie/reperfusion et la surcharge de pression11. Cependant, il existe une controverse quant à savoir si Nampt est bénéfique ou préjudiciable à la physiopathologie cardiaque9,11,12 et on ne sait toujours pas comment la biosynthèse myocardique du NAD+ est régulée par iNampt et eNampt dans des conditions pathologiques. Ici, nous démontrons que la concentration myocardique de NAD + est préservée malgré une diminution de l'expression d'iNampt chez la souris après une constriction aortique transversale (TAC). Mécaniquement, eNampt dérivé de monocytes contribue à la préservation des niveaux myocardiques de NAD+ suffisants pour la compensation fonctionnelle de la surcharge de pression. Nos études fournissent des informations mécanistes sur la régulation inter-tissulaire de l'homéostasie cardiaque impliquant des monocytes dérivés de la moelle osseuse et pointent vers une stratégie thérapeutique de manipulation de cette voie pour le traitement de l'insuffisance cardiaque.

Nous avons d'abord examiné l'impact de la biosynthèse du NAD + Nampt-dépendante sur la réponse au stress à une blessure dans des cardiomyocytes en culture de rats nouveau-nés. La doxorubicine (DOX), un médicament anticancéreux à base d'anthracycline, présente une cardiotoxicité par le biais de plusieurs mécanismes, notamment une augmentation du stress oxydatif, une détérioration myofibrillaire et une dérégulation intracellulaire du Ca2+13. La stimulation avec DOX a diminué de manière significative la concentration de NAD + et l'activité enzymatique de Sirt1 et, à l'inverse, a augmenté l'acétylation des protéines nucléaires dans les cardiomyocytes, ce qui a été encore exagéré par un traitement concomitant avec FK866, un inhibiteur sélectif de Nampt14 (Fig. 1a – c). Il a été rapporté que Sirt1 régule la fonction mitochondriale et l'utilisation de l'énergie et protège les cardiomyocytes de la mort cellulaire et de la dégénérescence15,16. De manière constante, la diminution de la viabilité cellulaire induite par DOX et des niveaux d'expression de gènes pertinents pour la fonction mitochondriale, tels que Sod2, Ppargc1a, Pparg et mt-Co3, a été encore exagérée par le traitement avec FK866 (Fig. 1d, e). Inversement, le traitement des cardiomyocytes stimulés par DOX avec NMN a augmenté de manière significative la concentration de NAD +, l'activité enzymatique de Sirt1, une diminution de l'acétylation des protéines nucléaires et la restauration de la viabilité cellulaire et des niveaux d'expression des gènes mitochondriaux (Fig. 1f – j). Ces résultats suggèrent que la biosynthèse dépendante de Nampt du NAD+ protège contre la cardiotoxicité induite par la DOX dans les cellules en culture.

Rôle protecteur de la biosynthèse Nampt-dépendante de l'activation de NAD + et Sirt1 contre la toxicité induite par DOX dans les cardiomyocytes néonataux de rat.

( a ) Concentrations de NAD + dans les cardiomyocytes traités avec mock (n = 7), DOX (n = 7) ou DOX + FK866 (n = 11). **P < 0,01. ( b ) Activité désacétylase Sirt1 dans les cardiomyocytes traités avec un faux (n = 4), DOX (n = 5) ou DOX + FK866 (n = 5). *P < 0,05, **P < 0,01. ( c ) Analyse par immunoblot de la lysine acétylée (Ac-K) et de l'histone H3 dans la fraction nucléaire des cardiomyocytes traités avec du mock, du DOX ou du DOX + FK866. Les quantifications d'Ac-K/histone H3 sont présentées sous forme de graphiques à barres (n = 8, dans chaque groupe). **P < 0,01. ( d ) Viabilité cellulaire dans les cardiomyocytes traités avec mock, DOX ou DOX + FK866 (n = 6, dans chaque groupe). **P < 0,01. ( e ) Les niveaux d'ARNm des gènes associés aux mitochondries dans les cardiomyocytes traités avec mock (n = 7), DOX (n = 7) ou DOX + FK866 (n = 5). *P < 0,05 versus mock, **P < 0,01 versus mock, #P < 0,05 versus DOX, ##P < 0,01 versus DOX. ( f ) Concentrations de NAD + dans les cardiomyocytes traités avec du faux (n = 4), du DOX (n = 3) ou du DOX + NMN (n = 4). *P < 0,05, **P < 0,01. ( g ) Activité désacétylase Sirt1 dans les cardiomyocytes traités avec mock (n = 4), DOX (n = 5) ou DOX + NMN (n = 5). *P < 0,05, **P < 0,01. ( h ) Analyse par immunotransfert d'Ac-K et de l'histone H3 dans des cardiomyocytes traités avec du mock, du DOX ou du DOX + NMN. Les quantifications d'Ac-K/histone H3 sont présentées sous forme de graphiques à barres (n = 8, dans chaque groupe). *P < 0,05, **P < 0,01. (i) Viabilité cellulaire dans les cardiomyocytes traités avec mock, DOX ou DOX + NMN (n = 6, dans chaque groupe). **P < 0,01. ( j ) Les niveaux d'ARNm des gènes associés aux mitochondries dans les cardiomyocytes traités avec mock (n = 7), DOX (n = 5) ou DOX + NMN (n = 5). **P < 0,01 versus mock, #P < 0,05 versus DOX, ##P < 0,01 versus DOX.

Ensuite, pour examiner le lien physiopathologique entre la biosynthèse du NAD + dépendant de Nampt et l'insuffisance cardiaque, nous avons imposé une surcharge de pression aux souris en produisant du TAC. Dans ce modèle, nous avons pu induire une hypertrophie cardiaque adaptative avec fonction systolique préservée à 2 semaines et inadaptée et insuffisance cardiaque à 8 semaines après l'opération (tableau supplémentaire 1). À 8 semaines après l'opération, les niveaux d'ARNm et de protéines de Nampt étaient significativement diminués dans les cœurs opérés par TAC par rapport aux cœurs opérés de manière fictive (Fig. 2a, b). Mais étonnamment, l'activité enzymatique ainsi que les niveaux d'ARNm et de protéines de Sirt1 et le niveau d'acétylation de la protéine de la boîte à fourche O1 (FoxO1) étaient inchangés entre les cœurs opérés par TAC et fictifs (Fig. 2c – f). Malgré la diminution des niveaux de protéines iNampt, la concentration de NAD + a été préservée dans les cœurs opérés par TAC, comme l'a révélé une mesure directe à l'aide d'un système HPLC (Fig. 2g). Nous avons également constaté que la concentration de NMN était significativement plus élevée dans les cœurs opérés par TAC que dans les cœurs opérés de manière fictive (Fig. 2h). Ces résultats suggèrent qu'une augmentation de l'apport myocardique de NMN pourrait compenser une diminution de la synthèse de NMN dépendante d'iNampt pour atteindre la concentration constante de NAD+ dans les cœurs opérés par TAC.

Concentration de NAD + myocardique compensée et activité de Sirt1 malgré une diminution de l'expression de Nampt dans les cœurs opérés par TAC.

( a ) Les niveaux d'ARNm de Nampt dans les cœurs à 8 semaines après une opération TAC ou fictive (n = 5). ( b ) Analyse par immunotransfert de Nampt dans les cœurs à 8 semaines après l'opération. Les quantifications de Nampt/GAPDH sont présentées sous forme de graphiques à barres (n = 5). ( c ) Les niveaux d'ARNm de Sirt1 dans les cœurs à 8 semaines après l'opération (n = 5). ( d ) Analyse par immunotransfert de Sirt1 dans les cœurs à 8 semaines après l'opération. Les quantifications du Sirt1/GAPDH sont présentées sous forme de graphiques à barres (n = 5). ( e ) Activité désacétylase Sirt1 dans les cœurs à 8 semaines après l'opération (TAC, n = 5; simulacre; n = 8). ( f ) Analyse par immunotransfert de FoxO1 acétylé (Ac-FoxO1) et FoxO1 dans les cœurs à 8 semaines après l'opération. Les quantifications de l'Ac-FoxO1/FoxO1 sont présentées sous forme de graphiques à barres (n = 4). ( g ) concentrations de NAD + (TAC, n = 10; simulacre, n = 11) et (H) concentrations de NMN (TAC, n = 5; simulacre, n = 4) dans les cœurs à 8 semaines après l'opération. *P < 0,05, **P < 0,01, NS, non significatif.

Chez les souris opérées par TAC, les taux plasmatiques de protéine eNampt et de NMN ont été significativement augmentés, par rapport aux souris opérées de manière fictive (Fig. 3a, b), ce qui suggère que l'augmentation de la biosynthèse dépendante d'eNampt du NMN plasmatique peut contribuer à l'augmentation. dans les niveaux de NMN myocardique chez les souris opérées par TAC. De plus, le traitement de cardiomyocytes néonataux de rat avec du sérum de souris opéré par TAC a induit une activité de désacétylase de Sirt1 significativement plus élevée que celle avec du sérum de souris opéré de façon fictive (Fig. 3c), ce qui suggère que l'augmentation de la biosynthèse dépendante d'eNampt du NMN plasmatique était suffisante pour l'activation. de Sirt1 dans le myocarde.

CD11b + monocytes comme sources possibles d'augmentation de la protéine eNampt dans le sang périphérique des souris opérées par TAC.

( a ) Analyse par immunotransfert d'eNampt dans le plasma à 8 semaines après l'opération TAC (n = 16) ou fictive (n = 17). Les quantifications de l'eNampt sont présentées sous forme de graphiques à barres. ( b ) Concentrations de NMN dans le plasma à 8 semaines après l'opération (n = 6). ( c ) Activité désacétylase Sirt1 dans des cardiomyocytes néonataux de rat traités avec du sérum de souris à 8 semaines après une opération TAC (n = 10) ou fictive (n = 3). ( d ) Les niveaux d'ARNm de Nampt dans des cellules mononucléaires isolées du sang périphérique à 8 semaines après une opération TAC (n = 8) ou fictive (n = 9). ( e ) Les niveaux d'ARNm de Nampt dans les cellules CD11b - et CD11b + dans le sang périphérique (n = 3). Les données sont présentées sous forme d'induction de pli sur les cellules CD11b. ( f ) Les niveaux d'ARNm de Nampt dans les cellules CD11b + du sang périphérique à 8 semaines après l'opération TAC (n = 10) ou fictive (n = 5). *P < 0,05.

Dans le but de rechercher les sources possibles d'eNampt plasmatique accru, nous avons examiné les niveaux d'expression de la protéine Nampt dans les tissus de souris après une opération TAC ou fictive. Parmi les tissus examinés, seule la rate a montré une augmentation significative de l'expression de Nampt après l'opération TAC (Figure 1 supplémentaire). Nous avons également constaté que les niveaux d'expression de l'ARNm de Nampt étaient significativement augmentés dans les cellules mononucléaires isolées du sang périphérique de souris opérées par TAC (Fig. 3d). Pour déterminer quelle sous-population contribue potentiellement à l'augmentation de l'expression de Nampt dans les cellules mononucléaires périphériques, nous avons séparé les cellules des cellules mononucléaires périphériques de souris non opérées à l'aide du marqueur de lignée myélomonocytaire CD11b (Figure supplémentaire 2a) et avons constaté que les expressions d'ARNm de Nampt étaient significativement plus élevées dans les cellules CD11b + que dans CD11b - cellules (Fig. 3e). De plus, les expressions d'ARNm de Nampt dans les cellules CD11b + des souris opérées par TAC étaient significativement plus élevées que celles des souris opérées de manière fictive (Fig. 3f). Les cellules CD11b + isolées à partir de cellules mononucléaires périphériques ont montré des niveaux d'expression élevés d'ARNm Emr1 (Figure supplémentaire 2b) et ont donc été considérées comme des monocytes CD11b +, F4 / 80 +. Étant donné que la rate est un réservoir de monocytes extramédullaires qui sont mobilisés en réponse à l'ischémie myocardique17, nous avons émis l'hypothèse que les monocytes pourraient être la source possible d'une augmentation de la protéine eNampt plasmatique.

Pour examiner l'importance fonctionnelle de Nampt dans la compensation hémodynamique de la surcharge de pression, nous avons administré par voie intrapéritonéale FK866 ou simulé à des souris opérées par TAC ou fictives. Puisqu'une diminution de l'expression cardiaque d'iNampt et une augmentation de l'expression plasmatique d'eNampt ont été observées dès 1 semaine après l'opération TAC (Figure 3 supplémentaire), nous avons commencé l'administration de FK866 le jour de l'opération. L'examen échocardiographique a révélé que l'administration de FK866 pendant 1 semaine induisait une augmentation significative de la dimension télédiastolique ventriculaire gauche (LVEDD) et une diminution significative du raccourcissement fractionnaire (FS) chez les souris opérées par TAC, alors que ces paramètres étaient inchangés chez les souris opérées de manière fictive. (Tableau supplémentaire 2). En conséquence, environ 65% des souris opérées par TAC sont mortes en 1 semaine après traitement avec FK866 (Fig. 4a). Chez les souris opérées par TAC, le traitement FK866 a induit une diminution significative de la concentration myocardique de NAD + (Fig. 4b) et de l'activité désacétylase de Sirt1 (Fig. 4c) et une augmentation du niveau d'acétylation de FoxO1 (Fig. 4d), bien que ces changements aient été non observé chez les souris opérées de manière fictive (Fig. 4b – d). En conséquence, la réduction de NAD + induite par FK866 a entraîné une diminution significative des niveaux d'expression des gènes pertinents pour la fonction mitochondriale, tels que Tfam, Pparg et Esrra (Fig. 4e) et une augmentation significative du nombre de cardiomyocytes TUNEL-positifs ( Fig. 4f, g). Ces résultats suggèrent que l'inhibition fonctionnelle de Nampt a perturbé le mécanisme homéostatique des niveaux de NAD + myocardique et de l'activité de Sirt1 dépendante de NAD + et a ainsi induit une décompensation cardiaque chez des souris en surcharge de pression.

Décompensation cardiaque par traitement au FK866 chez des souris en surcharge de pression.

( a ) Courbes de survie de Kaplan-Meier des souris traitées avec FK866 (FK) ou fictives après opération TAC ou fictive (fictive + fictive, n = 5 ; fictive + FK, n = 5 ; TAC + fictive, n = 8 ; TAC + FK, n = 17). ( b ) Concentrations de NAD + dans les cœurs 7 jours après l'opération (simulation + simulation, n = 3 ; simulation + FK, n = 3 ; TAC + simulation, n = 8 ; TAC + FK, n = 5). ( c ) Activité désacétylase Sirt1 dans les cœurs à 7 jours après l'opération (simulation + simulation, n = 4 ; simulation + FK, n = 4 ; TAC + simulation, n = 7 ; TAC + FK, n = 5). ( d ) Analyse par immunoblot de Ac-FoxO1 et FoxO1 dans les cœurs à 7 jours après l'opération (simulation + simulation, n = 3 ; simulation + FK, n = 3 ; TAC + simulation, n = 7 ; TAC + FK, n = 5 ). Les quantifications de l'Ac-FoxO1/FoxO1 sont présentées sous forme de graphiques à barres. ( e ) Les niveaux d'ARNm des gènes associés aux mitochondries dans les cœurs 7 jours après l'opération (TAC + mock, n = 12 ; TAC + FK, n = 6). ( f ) Coloration TUNEL (vert) avec coloration nucléaire avec DAPI (bleu) et coloration WGA (rouge) montrant les contours des cardiomyocytes chez les souris traitées avec FK866 ou simulées à 4 jours après l'opération TAC. Barres d'échelle, 40 μm. ( g ) Quantification des cardiomyocytes TUNEL-positifs dans les cœurs 4 jours après l'opération (TAC + mock, n = 6; TAC + FK, n = 5). *P < 0,05, **P < 0,01, NS, non significatif.

Pour évaluer plus en détail si la diminution des niveaux myocardiques de NMN et de NAD + a provoqué une décompensation cardiaque chez les souris opérées par TAC traitées au FK866, nous avons administré par voie intrapéritonéale du NMN ou un faux à ces souris. Le traitement par NMN a considérablement amélioré les paramètres échocardiographiques tels que LVEDD et% FS (tableau supplémentaire 3) et a empêché la mort prématurée chez les souris opérées par TAC traitées au FK866 (Fig. 5a). Le traitement par NMN a restauré la concentration myocardique de NAD + (Fig. 5b), l'activité désacétylase de Sirt1 (Fig. 5c), le niveau d'acétylation de FoxO1 (Fig. 5d), les niveaux d'expression de gènes pertinents pour la fonction mitochondriale, tels que Sod2, Ppargc1a, Tfam, Pparg, Esrra et mt-Co3 (Fig. 5e) et le nombre de cardiomyocytes TUNEL-positifs (Fig. 5f, g). Collectivement, ces résultats suggèrent que la biosynthèse dépendante de Nampt de NAD + est essentielle pour l'activité de la désacétylase Sirt1 myocardique et la compensation fonctionnelle de la surcharge de pression chez la souris.

Prévention de la décompensation cardiaque induite par le FK866 par l'administration de NMN chez des souris en surcharge de pression.

( a ) Courbes de survie de Kaplan-Meier des souris opérées par TAC traitées avec FK866 (FK) + NMN (n = 9) ou FK + mock (n = 8). ( b ) Concentrations de NAD + dans les cœurs 7 jours après l'opération (n = 5). ( c ) Activité désacétylase Sirt1 dans les cœurs 7 jours après l'opération (FK + NMN, n = 7; FK + mock, n = 6). ( d ) Analyse par immunotransfert de Ac-FoxO1 et FoxO1 dans les cœurs 7 jours après l'opération (FK + NMN, n = 5 ; FK + mock, n = 5). Les quantifications de l'Ac-FoxO1/FoxO1 sont présentées sous forme de graphiques à barres. ( e ) Les niveaux d'ARNm des gènes associés aux mitochondries dans les cœurs 7 jours après l'opération (n = 4). ( f ) Coloration TUNEL (vert) avec coloration nucléaire au DAPI (bleu) et coloration WGA (rouge) montrant les contours des cardiomyocytes chez les souris traitées avec FK + NMN ou FK + mock à 4 jours après l'opération TAC. Barres d'échelle, 40 μm. ( g ) Quantification des cardiomyocytes TUNEL-positifs dans les cœurs à 4 jours après l'opération (n = 5). *P < 0,05, **P < 0,01.

L'augmentation de l'expression de Nampt dans les monocytes et la concentration plasmatique d'eNampt suggèrent un lien de causalité entre l'eNampt dérivé des monocytes et la compensation fonctionnelle dépendante de Nampt à la surcharge de pression. Pour tester l'importance de l'eNampt dérivé des monocytes dans ce processus, nous avons appauvri les monocytes/macrophages par traitement avec des liposomes de clodronate (CloLip) chez la souris18. Nous avons confirmé par analyse par cytométrie en flux que, chez les souris non opérées, CloLip induisait une réduction d'environ 3,2 fois du pourcentage de monocytes CD11b +, F4/80 + circulants 1 jour après le début du traitement (Fig. 6a, Figure supplémentaire 4a). Le pourcentage de monocytes CD11b+, F4/80+ a augmenté d'environ 3,1 fois 5 jours après l'opération TAC, mais il a été diminué d'environ 1,6 fois par un traitement CloLip concomitant (Fig. 6a, Figure supplémentaire 4b). En revanche, les populations de cellules CD11b +, F4/80 et de cellules CD11b -, F4/80 n'ont pas été modifiées de manière significative après le traitement par CloLip (Figure 4 supplémentaire). Les souris traitées avec CloLip sont devenues léthargiques et environ 75% des souris traitées avec CloLip sont mortes dans les 5 jours suivant l'opération TAC, bien que les souris traitées avec des liposomes témoins (CntrlLip) semblaient normales (Fig. 6b). L'examen échocardiographique a révélé une augmentation significative du LVEDD et une diminution significative du % FS chez les souris traitées avec CloLip, alors que ces paramètres étaient inchangés chez les souris traitées avec CntrlLip (tableau supplémentaire 4). Le traitement CloLip a induit une diminution significative de la protéine eNampt plasmatique (Fig. 6c) sans changement significatif de la protéine iNampt cardiaque (Fig. 6d), entraînant une diminution significative de la concentration de NAD + (Fig. 6e) et de l'activité désacétylase de Sirt1 (Fig. 6f) et une augmentation du niveau d'acétylation de FoxO1 (Fig. 6g). La réduction de NAD + induite par CloLip a entraîné une augmentation significative du nombre de cardiomyocytes positifs au TUNEL (Fig. 6h, i). Ces résultats suggèrent que la réduction des cellules CD11b + médiée par les liposomes de clodronate a diminué la protéine plasmatique eNampt et a ainsi induit une décompensation cardiaque chez les souris en surcharge de pression.

Décompensation cardiaque par traitement avec CloLip chez des souris en surcharge de pression.

( a ) Analyse cytométrique en flux représentative démontrant les monocytes CD11b +, F4 / 80 + dans le sang périphérique de souris à 1 jour après traitement avec des liposomes de clodronate (CloLip) ou des liposomes témoins (CntrlLip) et des souris opérées par TAC à 5 jours après opération et traitement avec CloLip ou CntrlLip. ( b ) Courbes de survie de Kaplan-Meier des souris opérées par TAC traitées avec CloLip (n = 12) ou CntrlLip (n = 8). ( c ) Analyse par immunotransfert d'eNampt dans le plasma 5 jours après l'opération TAC (CloLip, n = 5; CntrlLip, n = 4). Les quantifications de l'eNampt sont présentées sous forme de graphiques à barres. ( d ) Analyse par immunotransfert d'iNampt dans les cœurs 5 jours après l'opération TAC (CloLip, n = 5; CntrlLip, n = 4). Les quantifications de Nampt/GAPDH sont présentées sous forme de graphiques à barres. ( e ) Concentrations de NAD + dans les cœurs 5 jours après l'opération TAC (CloLip, n = 5; CntrlLip, n = 7). ( f ) Activité désacétylase Sirt1 dans les cœurs 5 jours après l'opération TAC (CloLip, n = 5; CntrlLip, n = 4). ( g ) Analyse par immunoblot de Ac-FoxO1 et FoxO1 dans les cœurs 5 jours après l'opération TAC (CloLip, n = 4; CntrlLip, n = 4). Les quantifications de l'Ac-FoxO1/FoxO1 sont présentées sous forme de graphiques à barres. ( h ) Coloration TUNEL (vert) avec coloration nucléaire au DAPI (bleu) et coloration WGA (rouge) montrant les contours des cardiomyocytes chez les souris opérées par TAC à 2 jours après l'opération et le traitement avec des liposomes de clodronate (CloLip) ou des liposomes de contrôle (CntrlLip ). Barres d'échelle, 40 μm. (i) Quantification des cardiomyocytes TUNEL-positifs 2 jours après l'opération TAC (CloLip, n = 5 ; CntrlLip, n = 6). *P < 0,05, **P < 0,01, NS, non significatif.

Nous avons en outre évalué si le traitement NMN prévenait la décompensation cardiaque induite par CloLip chez les souris en surcharge de pression. Le traitement par NMN a considérablement amélioré les paramètres échocardiographiques tels que LVEDD et% FS (tableau supplémentaire 4) et a empêché la mort prématurée chez les souris opérées par TAC traitées au CloLip (Fig. 7a). Le traitement par NMN a restauré la concentration myocardique de NAD + (Fig. 7b), l'activité désacétylase de Sirt1 (Fig. 7c), le niveau d'acétylation de FoxO1 (Fig. 7d) et le nombre de cardiomyocytes TUNEL-positifs (Fig. 7e, f). Collectivement, ces résultats suggèrent que l'eNampt dérivé des monocytes est crucial pour la synthèse myocardique de NAD+ suffisante pour la compensation fonctionnelle de la surcharge de pression chez la souris.

Prévention de la décompensation cardiaque induite par CloLip par administration de NMN chez des souris en surcharge de pression.

( a ) Courbes de survie de Kaplan-Meier des souris opérées par TAC traitées avec CloLip + NMN (n = 12) ou CloLip + Mock (n = 24). ( b ) Concentrations de NAD + dans les cœurs 5 jours après l'opération TAC (CloLip + NMN, n = 3; CloLip + Mock, n = 5). ( c ) Activité désacétylase Sirt1 dans les cœurs à 5 jours après l'opération TAC (n = 4). ( d ) Analyse par immunotransfert d'Ac-FoxO1 et FoxO1 dans les cœurs 5 jours après l'opération TAC (n = 4). Les quantifications de l'Ac-FoxO1/FoxO1 sont présentées sous forme de graphiques à barres. ( e ) Coloration TUNEL (vert) avec coloration nucléaire au DAPI (bleu) et coloration WGA (rouge) montrant les contours des cardiomyocytes chez les souris opérées par TAC à 2 jours après l'opération et le traitement avec CloLip + NMN ou CloLip + mock. Barres d'échelle, 40 μm. ( f ) Quantification des cardiomyocytes TUNEL-positifs dans les cœurs à 5 jours après l'opération TAC (n = 5). *P < 0,05, **P < 0,01.

La compensation myocardique à une charge de travail accrue est obtenue par des processus complexes et intégratifs impliquant non seulement un certain nombre de voies de signalisation intracellulaires, mais également des réseaux de communication intercellulaire et inter-tissus. Notre présente étude démontre un mécanisme jusqu'alors inconnu de régulation inter-tissulaire de l'homéostasie cardiaque par les monocytes circulants. Nous apportons la preuve qu'une augmentation du NMN circulant médiée par la régulation à la hausse de l'eNampt dérivé des monocytes compense une diminution de l'expression myocardique de l'iNampt pour maintenir le niveau de NAD + myocardique chez les souris en surcharge de pression (Fig. 8).

Mécanisme homéostatique de la biosynthèse dépendante de l'eNampt dérivée des monocytes du NAD + myocardique dans la compensation cardiaque à la surcharge de pression.

( a ) La surcharge de pression diminue l'expression cardiaque d'iNampt, mais la concentration myocardique de NAD + et l'activité de Sirt1 désacétylase sont inchangées. La régulation à la hausse de l'eNampt dérivé des monocytes contribue à la préservation des niveaux de NAD + myocardique et à la compensation fonctionnelle de la surcharge de pression. ( b ) L'inhibition pharmacologique de Nampt par FK866 ou l'épuisement des monocytes par CloLip supprime la régulation positive compensatoire de eNampt dérivé de monocytes et perturbe le mécanisme homéostatique des niveaux de NAD + myocardique et de l'activité de Sirt1, entraînant une décompensation cardiaque induite par une surcharge de pression. ( c ) L'administration systémique de NMN restaure les niveaux de NAD + myocardique et l'activité de Sirt1 et empêche la décompensation cardiaque induite par FK866 ou CloLip en cas de surcharge de pression.

Il a été rapporté que la régulation à la baisse de Nampt augmentait la mort cellulaire apoptotique dans les cardiomyocytes de rats nouveau-nés en culture11 et nous avons également observé que la biosynthèse dépendante de Nampt du NAD + protégeait contre la cardiotoxicité induite par la DOX. La surexpression cardiaque spécifique de Nampt ou l'administration de NMN ont augmenté les niveaux de NAD + myocardique et protégé le cœur de l'ischémie ou des lésions d'ischémie / reperfusion chez la souris, indiquant que Nampt est crucial pour la synthèse myocardique de NAD + et la cardioprotection dans les cœurs stressés. En revanche, Pillai et al. ont rapporté que la surexpression cardiaque spécifique de Nampt induisait spontanément une hypertrophie cardiaque et une fibrose interstitielle chez la souris et que l'inactivation hétérozygote de Nampt atténuait l'hypertrophie cardiaque induite par l'isoprotérénol et l'angiotensine II, indiquant que Nampt est un régulateur positif du remodelage cardiaque indésirable9. Compte tenu des niveaux d'expression beaucoup plus élevés de Nampt myocardique chez la souris rapportés par Pillai et al., une production excessive de Nampt pourrait être préjudiciable à la physiopathologie cardiaque. Nos données actuelles font clairement avancer notre compréhension du rôle jusqu'ici controversé de Nampt dans la réponse au stress à la surcharge hémodynamique, démontrant que l'inhibition de Nampt induit une décompensation cardiaque dans la phase précoce de la surcharge de pression.

Récemment, eNampt, comme les cytokines et les facteurs de croissance, a été signalé comme agissant directement sur les cellules, mais les actions d'eNampt sur les cardiomyocytes sont énigmatiques. Le traitement avec eNampt a atténué l'apoptose induite par H2O2 dans les cardiomyocytes H9c219 et l'administration intraveineuse d'eNampt au moment de la reperfusion a réduit la taille de l'infarctus du myocarde dans un modèle murin d'ischémie/reperfusion20. Au contraire, Montecucco et al. ont rapporté que l'inhibition pharmacologique de Nampt réduisait les lésions myocardiques médiées par les neutrophiles dans la phase précoce de la reperfusion21. On ne sait toujours pas si eNampt dérivé de monocytes a des effets biologiques sur les cardiomyocytes, mais nous avons constaté que le NMN plasmatique était significativement augmenté chez les souris opérées par TAC et que le traitement des cardiomyocytes néonataux de rat avec du sérum de souris opéré par TAC induisait une activité de désacétylase significativement plus élevée de Sirt1. Par conséquent, le NMN pourrait être converti de manière extracellulaire à partir du NAM par eNampt au niveau systémique et utilisé comme substrat pour la biosynthèse du NAD + après le flux de transport dans les cellules via un transporteur NMN non identifié dans le cœur. D'autres études utilisant des modèles génétiques élaborés pour supprimer Nampt spécifiquement dans les cardiomyocytes ou les monocytes seront nécessaires pour disséquer la régulation coopérative du NAD+ myocardique par iNampt et eNampt dans les cœurs soumis à une surcharge de pression et à une ischémie/reperfusion.

La biosynthèse de NAD+ dépendante de Nampt est un déterminant clé de l'activité désacétylase des sirtuines6. Notre analyse de l'activité de la désacétylase de Sirt1 a révélé qu'elle était invariablement corrélée à la concentration de NAD+ myocardique à la fois in vitro et in vivo. Dans un modèle murin d'ischémie/reperfusion, la surexpression cardiaque spécifique de Sirt1 a réduit la taille de l'infarctus grâce à l'activation de FoxO1 et de la manganèse superoxyde dismutase, tandis que l'inactivation cardiaque spécifique de Sirt1 a exacerbé la lésion myocardique22. Cependant, des phénotypes contradictoires attribuables aux dosages géniques du transgène ont été observés dans le développement de l'hypertrophie cardiaque chez les souris présentant une surexpression cardiaque de Sirt1. Des niveaux faibles à modérés de surexpression de Sirt1 ont atténué la progression du remodelage et du dysfonctionnement cardiaque dépendant du vieillissement, mais des niveaux élevés de surexpression de Sirt1 ont augmenté le stress oxydatif et l'apoptose, entraînant un dysfonctionnement cardiaque23,24. Les effets bénéfiques de Sirt1 sont médiés par une combinaison de plusieurs mécanismes tels que la désacétylation du récepteur activé par les proliférateurs de peroxysomes-γ coactivateur-1α pour moduler la fonction mitochondriale16,25, la régulation à la hausse de la manganèse superoxyde dismutase pour piéger ROS22,26, la désacétylation de p53 pour inhibant la mort cellulaire apoptotique27 et la désacétylation de FoxO1 pour induire l'autophagie28. A l'inverse, Oka et al. ont rapporté que Sirt1 surexprimé, en formant un complexe avec le récepteur α activé par les proliférateurs de peroxysomes, supprimait les voies des récepteurs liés aux œstrogènes, entraînant un dysfonctionnement mitochondrial et la progression de l'insuffisance cardiaque29. Chez les souris opérées par TAC, les niveaux d'expression des gènes pertinents pour la fonction mitochondriale étaient corrélés à l'activité de la désacétylase de Sirt1, soit lorsqu'elle était diminuée par un traitement au FK866, soit lorsqu'elle était restaurée par un traitement au NMN, soutenant la possibilité que la biosynthèse dépendante de Nampt de Le NAD+ myocardique est impliqué dans la régulation de la fonction mitochondriale. Dans la mesure où il a été rapporté que Sirt3 et Sirt7 ainsi que Sirt1 ont des rôles bénéfiques dans le cœur15, d'autres études seront nécessaires pour comprendre l'ensemble des mécanismes compensatoires facilités par la biosynthèse dépendante d'eNampt de NAD+ et l'activation dépendante de NAD+ de Sirt1 et d'autres sirtuines dans les cœurs surchargés de pression.

Dans le cerveau et le pancréas, les niveaux d'expression basaux d'iNampt sont extrêmement faibles et le NMN circulant maintenu par le plasma eNampt fonctionne comme un substrat essentiel pour la biosynthèse intracellulaire du NAD+7. Des études récentes ont démontré l'efficacité de la supplémentation en NMN pour la restauration du NAD+ dans ces tissus7,10,30,31. Dans les conditions pathologiques dans lesquelles les niveaux de NMN circulants diminuent, la supplémentation en NMN peut apporter un bénéfice thérapeutique. Il a été rapporté que les niveaux de protéine Nampt ainsi que de NAD+ diminuent avec le vieillissement dans plusieurs tissus10,32. Nous avons observé que les souris âgées présentaient une diminution significative des niveaux de NAD + myocardique et de protéine eNampt plasmatique, par rapport aux jeunes souris, bien que les niveaux de protéine iNampt myocardique soient inchangés (Figure supplémentaire S5). Il est bien connu que la prévalence de l'insuffisance cardiaque augmente avec l'âge et que les insuffisants cardiaques âgés ont un pronostic plus sombre que les plus jeunes33. Il est logique de supposer que le déclin lié à l'âge de l'approvisionnement en NMN médié par eNampt pourrait entraîner une diminution du NAD + myocardique, entraînant une susceptibilité accrue à l'insuffisance cardiaque avec une morbidité et une mortalité plus élevées chez les personnes âgées. De plus, une étude récente a démontré que des niveaux élevés d'eNampt plasmatique sont associés à des résultats cliniques favorables chez les patients atteints de cardiomyopathie dilatée34 et notre étude peut fournir une explication mécaniste probable de la corrélation entre l'eNampt plasmatique et les phénotypes d'insuffisance cardiaque. Notre étude a mis en évidence un nouveau mécanisme de régulation circulante médiée par eNampt du NAD + myocardique dans des conditions de stress et a ouvert la possibilité d'explorer si la restauration du NAD + myocardique a un potentiel thérapeutique pour l'insuffisance cardiaque.

Toutes les expériences ont été approuvées par le Comité institutionnel de protection et d'utilisation des animaux de l'Université d'Osaka et réalisées conformément aux directives de l'Université d'Osaka. Des souris C57BL/6J ont été achetées chez CLEA Japan, Inc. Pour le fonctionnement du TAC, nous avons anesthésié des souris mâles âgées de 8 à 9 semaines par injection intrapéritonéale de chlorhydrate de médétomidine (0,3 mg/kg), de midazolam (4 mg/kg) et de butorphanol ( 5 mg/kg)35 et l'anesthésie a été surveillée en pinçant l'orteil. La respiration était contrôlée artificiellement avec un volume courant de 0,2 ml et une fréquence respiratoire de 110 respirations/min. Après la sternotomie médiane, l'aorte transversale entre les branches des artères brachiocéphaliques droite et carotide commune gauche a été resserrée avec des cordes de soie 7–0 en ligaturant l'aorte avec une attelle d'une aiguille émoussée de calibre 27, qui a été retirée après la ligature. La poitrine a ensuite été fermée et les souris ont pu se remettre de l'anesthésie tandis que leur température corporelle était maintenue à 37 ° C. Une analgésie post-opératoire (méloxicam, 5 mg/kg/24 h) a été administrée par voie sous-cutanée pendant 48 h. Le chirurgien n'avait aucune information sur les souris utilisées dans cette étude. Pour inhiber la biosynthèse Nampt-dépendante du NAD+ in vivo, nous avons administré du FK866 (10 mg/kg/j) ou mock (huile de maïs) par injection intrapéritonéale à des souris pendant la durée de l'expérience36. Pour le traitement NMN, nous avons administré du NMN (500 mg/kg) ou du mock (solution saline normale) par injection intrapéritonéale deux fois par jour pendant la durée de l'expérience10,30. Le clodronate et les liposomes témoins (Clophosome, Combo Kit) ont été achetés chez FormuMax Scientific, Inc. Pour induire la déplétion des monocytes et des macrophages, une dose de 25 μl de clodronate ou de liposomes témoins a été administrée par voie intrapéritonéale. Pour l'évaluation des dimensions cardiaques et de la contractilité, une échocardiographie transthoracique a été réalisée sur des souris conscientes avec un système d'imagerie Vevo 770 utilisant une sonde linéaire de 25 MHz (Visual Sonics Inc.). Les souris ont été sacrifiées pour recueillir des échantillons de tissus après 24 h de famine.

Les expériences pour les cultures primaires de cardiomyocytes ont été approuvées par le Comité d'étude animale de l'Université d'Osaka et ont été réalisées conformément aux directives de l'Université d'Osaka. En bref, l'euthanasie par dislocation cervicale a été réalisée par un personnel qualifié avant de récolter le tissu cardiaque de rats Wistar âgés d'un jour conformément aux directives de l'American Veterinary Medical Association pour l'euthanasie des animaux. Les ventricules ont été hachés et digérés dans une solution saline équilibrée de Hank sans Ca2+ (HBSS) (Hyclone) contenant 0,1 % de trypsine (Hyclone) et 70 u/ml de collagénase (Worthington Biochemical Corp.). Les cardiomyocytes ont été enrichis après pré-placage, plaqués à une densité de champ de 1 × 105 cellules/cm2 et cultivés dans du DMEM additionné de 10 % de sérum bovin fœtal (BGS) pendant 24 h. Après privation de sérum (1% BGS) pendant 24 h, les cardiomyocytes ont été stimulés avec DOX (1 μM pendant 3 h) et l'inhibiteur allostérique de Nampt FK866 (500 nM pendant 24 h) ou NMN (500 μM pendant 24 h)10. DOX a été acheté auprès de Sigma-Aldrich et FK866 et NMN ont été achetés auprès de Cayman Chemical et Sigma-Aldrich, respectivement. La viabilité cellulaire a été déterminée à l'aide du test de prolifération cellulaire CellTiter 96 AQueous One Solution (Promega) qui est basé sur la conversion métabolique d'un composé de tétrazolium MTS en un produit coloré par des cellules vivantes.

Les cellules ont été lysées et les tissus ont été homogénéisés dans un tampon (Tris 20 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM, EDTA 5 mM, pH 8,0, Na3VO4 100 mM, 0,5 % Nonidet P-40 et inhibiteur de protéase Complete Mini (Roche Applied Science)). Pour la détection d'Ac-FoxO1, les tissus ont été homogénéisés dans un tampon contenant 10 mM de NAM et 1 μM de trichostatine A. Pour le fractionnement nucléaire, les cellules ont été lysées dans un tampon (10 mM HEPES, pH 7,9, 1,5 mM MgCl2, 10 mM KCl, 0,5 mM DTT , 0,05 % Nonidet P-40, 10 mM NAM, 1 μM de trichostatine A et inhibiteur de protéase Complete Mini), incubé à 4 °C pendant 10 min et centrifugé à 4 °C à 800 g pendant 10 min. Le culot a été remis en suspension dans un tampon (Tris 50 mM, pH 8,0, NaCl 150 mM, désoxycholate de sodium 0,5 %, Nonidet P-40 1 % et SDS 0,1 %, NAM 10 mM, trichostatine A 1 μM et inhibiteur de protéase Complete Mini), incubé à 4 °C pendant 30 min et centrifugé à 4 °C à 10.400 g pendant 20 min. Le surnageant a été aliquoté en tant que fraction nucléaire. Pour la préparation d'échantillons de protéines de plasma de souris, protéines plasmatiques superflues (albumine, IgM, IgG, IgA, haptoglobine, transferrine, α1-antitrypsine, fibrinogène, α 2-macroglobuline, α1-glycoprotéine acide, apolipoprotéine AI, apolipoprotéine AII, complément C3 et transthyrétine ) a été épuisé à l'aide du système de cartouche rotative à élimination d'affinité multiple (Agilent Technologies) conformément aux instructions du fabricant.

Les échantillons de protéines ont été fractionnés avec SDS-PAGE, transférés sur des membranes PVDF (GE Healthcare Biosciences). Les membranes transférées ont été incubées avec un anticorps primaire, suivi d'un anticorps IgG anti-souris ou anti-lapin conjugué à la peroxydase de raifort (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.). Les signaux immunoréactifs ont été détectés avec le système de détection Western Blotting ECL Plus (GE Healthcare Biosciences) et visualisés à l'aide d'un analyseur d'images lumineuses (ImageQuant LAS 4000 mini ; GE Healthcare Biosciences). Les anticorps primaires suivants ont été utilisés : anticorps polyclonal de lapin anti-PBEF (Bethyl Laboratories, Inc.), anticorps polyclonal de lapin anti-Sirt1 (Merck Millipore), anticorps polyclonal de lapin anti-GAPDH (Abcam), anticorps polyclonal de lapin anti-Ac-FoxO1 ( Santa Cruz Biotechnology, Inc.), anticorps monoclonal de lapin anti-FoxO1 (Cell Signaling Technology, Inc.), anticorps polyclonal de lapin anti-Ac-K (Cell Signaling Technology, Inc.) et anticorps monoclonal de lapin anti-histone H3 (Cell Signaling Technology, Inc.).

L'ARN total a été extrait à l'aide du réactif TRIzol (Life Technologies, Inc.) et traité avec de la DNase pour éliminer l'ADN génomique contaminant à l'aide du kit sans ADN TURBO (Life Technologies, Inc.). L'ADNc simple brin a été transcrit en utilisant le kit de synthèse d'ADNc SuperScript VILO (Life Technologies, Inc) selon le protocole du fabricant. Nous avons effectué une analyse PCR quantitative en temps réel à l'aide du kit maître Light Cycler TaqMan (Roche Applied Science) avec les amorces spécifiques à la cible et les sondes correspondantes conçues par le système Universal ProbeLibrary (Roche Applied Science), conformément aux instructions du fabricant. Les conditions d'amplification étaient une dénaturation initiale de 10 min à 95 °C suivie de 45 cycles de 10 s à 95 °C et 25 s à 60 °C. Les produits de PCR individuels ont été analysés par analyse du point de fusion. Le niveau d'expression d'un gène a été normalisé par rapport à celui de la souris Gapdh et de l'ARNr 28S du rat en utilisant une méthode Ct comparative. Les séquences d'amorces et les numéros Universal Probe ont été conçus avec le logiciel ProbeFinder comme suit : souris Nampt, 5'-cctgttccaggctattctgttc-3' et 5'-atggtctttcccccaagc-3', n° 84 ; souris Sirt1, 5'-cgtggagacatttttaatcaggta-3' et 5'-gcttcatgatggcaagtgg-3', n° 104 ; souris Gapdh, 5'-tgtccgtcgtggatctgac-3' et 5'-cctgcttcaccacctttcttg-3', n° 80; souris Sod2, 5′-gacccattgcaaggaacaa-3′ et 5′-gtagtaagcgtgctcccacac-3′, n° 3; souris Ppargc1a, 5'-gaaagggccaaacagagaga-3' et 5'-gtaaatcacacggcgcctctt-3', n° 29 ; souris Tfam, 5'-caaaggatgattcggctcag-3' et 5'-aagctgaatatatgcctgcttttg-3', n° 94; souris Pparg, 5'-aagacaacggacaaatcacca-3' et 5'-gggggtgatatgtttgaacttg-3', n° 7; souris Nrf-1, 5'-tggagtccaagatgctaatgg-3' et 5'-gcgaggctggttaccaca-3', n°100 ; souris Esrra, 5'-ccttccctgctggacctc-3' et 5'-cgacaccagagcgttcact-3', n° 78; souris mt-Co3, 5'-tagcctcgtaccaacacatga-3' et 5'-agtggtgaaattcctgttgga-3', n° 66; Itgam de souris, 5'-aaggatgctgggggaggtc-3' et 5'-gtcataagtgacagtgctctggat-3', n° 16 ; souris Emr1, 5'-cctggacgaatcctgtgaag-3' et 5'-ggtgggaccacagagagttg-3', n° 1 ; ARNr 28S de rat, 5'-gctggctaggcagacaacat-3' et 5'-gacctgacgatgacagaggaa-3', n° 107 ; rat Sod2, 5'-tggacaaacctgagccctaa-3' et 5'-gacccaaagtcacgcttgata-3', n° 67; rat Ppargc1a, 5'-aaagggccaagcagagaga-3' et 5'-gtaaatcacacggcgcctctt-3', n° 29 ; rat Tfam, 5'-tcggtcagcatataacatttacg-3' et 5'-caagcctgatttacaagcttca-3', n° 79; rat Pparg, 5'-cccaatggttgctgattaca-3' et 5'-ggacgcaggctctactttga-3', n° 125 ; rat Nrf1, 5'-atagtcctgtctggggaaacc-3' et 5'-tccatgcatgaactccatct-3', n° 109 ; rat Esrra, 5'-ggtggacccattgccttt-3' et 5'-caccagggcgttaactgg-3', n° 78 ; rat mt-Co3, 5′-taaacccaagcccatgacc-3′ et 5′-agccggatgtaagtagaagagc-3′, n° 92.

Les niveaux de NAD+ et NMN ont été déterminés à l'aide d'un système HPLC (Shiseido Co., Ltd.) avec une colonne CAPCELL PAK C18 MGIII S5 (15 cm × 2,0 mm ; Shiseido) et une colonne YMC-Pack Pro C18 RS (15 cm × 4,6 mm ; YMC Co., Ltd.), respectivement, comme décrit précédemment10. Des tissus congelés ou du plasma de souris fraîchement prélevé, ou des cardiomyocytes en culture ont été extraits dans de l'acide perchlorique 1 M (200 μl/10 mg de tissu, 100 μl/10 μl de plasma, 500 μl/boîte de 6 cm). Les extraits ont été centrifugés à 15 000 tr/min pendant 10 min à 4 °C et les surnageants résultants ont été neutralisés dans du K2CO3 3 M sur de la glace pendant 10 minutes. Après clarification des extraits, des aliquotes de 100 μl ont été mélangées avec 50 μl de tampon A (50 mM K2HPO4/KH2PO4, pH 7,0) et 50 μl d'eau. Pour la mesure NAD +, la HPLC a été exécutée à un débit de 200 μl / min avec 100% de tampon A de 0 à 5 min, un gradient linéaire à 95% de tampon A / 5% de tampon B (100% de méthanol) de 5 à 6 min, 95 % de tampon A/5 % de tampon B de 6 à 11 min, un gradient linéaire jusqu'à 85 % de tampon A/15 % de tampon B de 11 à 13 min, 85 % de tampon A/15 % de tampon B de 13 à 23 min et un gradient linéaire à 100 % de tampon A de 23 à 24 min. Pour la mesure NMN, la HPLC a été exécutée à un débit de 700 μl/min avec 100 % de tampon A de 0 à 5 min, un gradient linéaire à 60 % de tampon A/40 % de tampon B de 5 à 10 min, 60 % de tampon A/40 % tampon B de 10 à 32,5 min, un gradient linéaire à 100 % tampon A de 32,5 à 35 min. NAD + et NMN ont généralement été élues à 14 min et 25 min, respectivement. Les niveaux de NAD+ et NMN ont été quantifiés sur la base de la surface du pic par rapport à une courbe standard et normalisés au poids des tissus congelés, au volume de plasma et au nombre de cardiomyocytes en culture.

L'activité de la désacétylase Sirt 1 a été déterminée avec le kit de détection d'activité fluorescente SIRT1/Drug Discovery (Enzo Life Science International) basé sur le peptide substrat Fluor de Lys – SIRT1. Des extraits protéiques (10 μg) de cœurs de souris ou de cardiomyocytes néonataux de rat ont été incubés avec le substrat peptidique fluorogène acétylé. La réaction a été effectuée à 37 ° C pendant 1 h et le signal fluorescent a été mesuré à 360 nm d'excitation et à 460 nm d'émission sur un lecteur de plaque de fluorescence (SH-9000Lab, Hitachi High-Technologies Corporation).

Du sang périphérique de souris a été prélevé et les cellules mononucléaires ont été séparées à l'aide d'Histopaque 1083 (Sigma-Aldrich). En bref, 1 ml de sang total a été soigneusement déposé sur 5 ml d'Histopaque 1083 dans un tube à centrifuger et le tube a été centrifugé à 400 g pendant 30 min à température ambiante. L'interface opaque, contenant la bande de cellules mononucléaires, a été collectée à l'aide d'une pipette Pasteur. La séparation des monocytes CD11b+ a été réalisée par tri à l'aide du système MACS (Miltenyi Biotech). Les cellules mononucléaires ont été incubées avec un anticorps anti-CD11b de rat (Merck Millipore) pendant 20 min à 4 °C, lavées dans du PBS additionné de 3 % de FBS, incubées avec des microbilles anti-rat pendant 20 min à 4 °C et lavées dans du PBS complété avec 3% de FBS. Les échantillons ont été passés sur une colonne MACS MS (Miltenyi Biotech) installée dans un aimant Miltenyi et les monocytes CD11b+ ont été élués de la colonne par lavage avec du PBS additionné de 3 % de FBS.

Le test TUNEL avec coloration nucléaire au DAPI a été réalisé, en utilisant le kit de détection d'apoptose in situ (Takara Bio Inc.). Les cœurs ont été excisés et immédiatement inclus dans le cryo-composé Tissue-Tek OCT (Sakura Finetek Japon). Des coupes fraîches congelées à 5 μm ont été fixées à l'acétone pendant 30 min à température ambiante puis lavées au PBS pendant 30 min. Les sections ont été incubées avec 0,3 % de H2O2 dans du méthanol pendant 30 min à température ambiante pour bloquer la peroxydase endogène, puis lavées trois fois avec du PBS pendant 5 min. Après incubation dans un tampon de perméabilisation pendant 5 min sur de la glace, les coupes ont été placées dans une chambre humidifiée et incubées avec l'enzyme TdT comprenant du dUTP conjugué à l'isothiocyanate de fluorescéine (FITC) pendant 60 min à 37 ° C. Pour différencier l'apoptose dans les myocytes et les non-myocytes, des coupes de tissus ont également été colorées avec de l'agglutinine de germe de blé conjuguée à Alexa Fluor 594 (WGA) (Life Technologies, Inc.) pendant 60 min à température ambiante, puis lavées trois fois avec du PBS pendant 5 min. Enfin, les sections ont été montées avec ProLong Gold Antifade Reagent (Life Technologies, Inc.). Les images ont été acquises avec un microscope à fluorescence (FSX100; Olympus) et le logiciel Olympus FSX-BSW (Olympus).

Le sang total obtenu par ponction cardiaque a été tamponné avec de l'EDTA, soumis à une lyse des globules rouges à l'aide de la solution de lyse BD FACS (BD Biosciences) et lavé dans du PBS additionné de 3 % de sérum de veau fœtal. Les leucocytes sanguins ont d'abord été incubés avec un anticorps FcR/III anti-souris de rat (2.4G2) (BD Biosciences) pour minimiser la liaison non spécifique de l'anticorps au FcR. Ils ont ensuite été incubés avec un anticorps anti-CD11b conjugué à l'APC (BD Biosciences) et un anticorps anti-F4/80 conjugué à la PE (BD Biosciences) pendant 10 min sur de la glace et lavés avec du PBS additionné de 3 % de sérum de veau fœtal. Les pourcentages de cellules CD11b+ et F4/80+ ont été analysés par le cytomètre en flux FACS Canto II (BD Biosciences) en utilisant le logiciel EXPO32 (Beckman Coulter).

Toutes les données sont présentées sous forme de moyenne ± SEM. La comparaison à deux groupes a été analysée par le test t de Student bilatéral non apparié et la comparaison à plusieurs groupes a été effectuée par ANOVA à 1 voie suivie du test HSD de Tukey-Kramer pour la comparaison des moyennes. Nous avons estimé les courbes de survie par la méthode de Kaplan-Meier et comparé les groupes par le test de Wilcoxon généralisé. Les valeurs de P < 0,05 ont été considérées comme statistiquement significatives.

Comment citer cet article : Yano, M. et al. La biosynthèse de NAD+ extracellulaire dérivée des monocytes protège le cœur contre la surcharge de pression. Sci. Rep. 5, 15857; doi : 10.1038/srep15857 (2015).

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Nous remercions Y. Hamanaka pour ses conseils techniques et M. Shimizu, H. Taniwaki, K. Kawaguchi, N. Miyagawa et Y. Ueda pour leur excellente assistance technique. Ce travail a été financé en partie par des subventions de la Japan Society for the Promotion of Science (KAKENHI 23390213, 24659390, 26670395 à HA, KAKENHI 21229010 à IK) et AMED-CREST, Japan Agency for Medical Research and Development.

Département de médecine cardiovasculaire, École supérieure de médecine de l'Université d'Osaka, Osaka, 565-0871, Suita, Japon

Masamichi Yano, Toru Oka, Chizuru Yabumoto, Yoko Kudo-Sakamoto et Yasushi Sakata

Département de médecine cardiovasculaire, École supérieure de médecine, Université de Tokyo, Tokyo, 113-8655, Bunkyo-ku, Japon

Hiroshi Akazawa, Takehiro Kamo, Yu Shimizu, Hiroki Yagi, Atsuhiko T. Naito et Issei Komuro

Unité d'enseignement de la pharmacie clinique, École supérieure des sciences pharmaceutiques, Université d'Osaka, Osaka, 565-0871, Suita, Japon

Chizuru Yabumoto

Département de médecine régénérative cardiovasculaire, École supérieure de médecine de l'Université d'Osaka, Osaka, 565-0871, Suita, Japon

Atsuhiko T.Naito et Jong-Kook Lee

Department of Advanced Clinical Science and Therapeutics, Graduate School of Medicine, The University of Tokyo, Tokyo, 113-8655, Bunkkyo-ku, Japon

Jun-ichi Suzuki

AMED-CREST, Agence japonaise pour la recherche et le développement médicaux, Tokyo, 100-0004, Chiyoda-ku, Japon

Hiroshi Akazawa, Toru Oka, Atsuhiko T. Naito, Jong-Kook Lee et Issei Komuro

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HA et IK ont planifié et conçu les expériences. IK a supervisé le projet. YM, TO, CY et YK-S. effectué les expériences. TK, Y.Sh. et HY a analysé les données. ATN, JK.L., JS et Y.Sa. conseillé sur les expériences. MY, HA et IK ont rédigé le manuscrit.

Les auteurs déclarent une absence d'intérêts financiers en compétition.

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Réimpressions et autorisations

Yano, M., Akazawa, H., Oka, T. et al. La biosynthèse de NAD+ extracellulaire dérivée des monocytes protège le cœur contre la surcharge de pression. Sci Rep 5, 15857 (2015). https://doi.org/10.1038/srep15857

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Reçu : 17 juillet 2015

Accepté : 05 octobre 2015

Publié: 02 novembre 2015

DOI : https://doi.org/10.1038/srep15857

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